目的：1.通过临床收集子宫腺肌病痛经患者子宫组织标本,观察子宫腺肌病在位内膜及异位病灶组织及对照组miR-21、芳香化酶(P450arom)、雌二醇(E2)、雌激素受体(ER)及Ras/Raf/P-C-Raf信号通路的蛋白表达；通过体外培养子宫腺肌病痛经患者病灶细胞,检测雌激素激活及雌激素剥夺状态下细胞抑制率及miR-21表达水平,探讨子宫腺肌病痛经发生机制与miR-21、P450arom、ER及Ras/Raf细胞信号通路因子的相关性,有望为未来研发防治子宫腺肌新药物提供实验依据和新的靶点。2.通过体外培养子宫腺肌病痛经患者病灶细胞,探讨加味芍药甘草汤复方、含药血清或其单体对子宫腺肌病病灶细胞增殖、凋亡及miR-21、芳香化酶(P450arom)、雌激素受体(ER)、细胞上清雌二醇(E2)、Ras/Raf/P-C-Raf信号通路相关因子表达水平的影响,拟从分子基因水平上阐明其治疗子宫腺肌病痛经的深层作用机理；通过药效筛选确定其有效部位,为临床优化处方和辩证用药提供依据和实验基础。方法：1.选取2006年1月—2014年6月于广州中医药大学第一附属医院妇科住院行子宫切除子宫腺肌病痛经患者蜡块60例,取同期59例因宫颈病变(CIN)行全宫切除患者蜡块作对照,采用免疫组织化学法检测子宫腺肌病痛经患者子宫在位内膜、异位病灶及对照组内膜、肌层中芳香化酶(P450arom)、雌激素受体(ER)、Ras、Raf的表达水平及其相关性；收集2013年1月-2014年7月广州中医药大学第一附属医院妇科住院要求手术治疗的子宫腺肌病痛经患者子宫组织,采用酶联免疫法、免疫蛋白印迹法、实时荧光定量(探针法)检测在位内膜及病灶组织雌二醇(E2)、P-C-Raf、miR-21表达水平,以同期因宫颈病变(CINⅢ)行全宫切除患者的子宫组织作为对照组；通过体外培养子宫腺肌病痛经患者病灶细胞,采用CCK-8法和实时荧光定量(探针法)检测雌激素激活状态及剥夺状态、阻断雌激素受体、抑制Ras表达后细胞抑制率及miR-21表达水平。2.采用免疫细胞化学法、酶联免疫法、实时荧光定量(探针法)、流式细胞技术、CCK-8法观察加味芍芍药甘草汤、含药血清或其单体对体外培养子宫腺肌病痛经患者病灶细胞miR-21、雌激素受体(ER)、芳香化酶(P450arom)、雌二醇(E2)、Ras/Raf信号通路因子(Ras、Raf)、细胞凋亡、细胞抑制的影响。以米非司酮组、不含血清培养液及空白血清组作为对照组。结果：1、子宫腺肌病与正常子宫组织E2、ER、P450arom、Ras、Raf的表达：子宫腺肌病异位病灶、在位内膜中E2、ER、P450arom表达水平较正常子宫肌层、内膜表达水平升高,子宫腺肌病子宫组织中E2、ER、P450arom总体表达水平较正常子宫组织亦明显升高；子宫腺肌病异位病灶及在位内膜E2表达水平无明显差异；P450arom主要表达在胞浆,子宫腺肌病在位内膜与异位病灶之间表达水平无明显差异(P>0.05)；ER主要表达在胞核,子宫腺肌病异位病灶ER表达水平较其在位内膜表达水平明显升高(P<0.05)；Rass、Raf主要表达在胞浆与胞膜,子宫腺肌病异位病灶及在位内膜Ras、 Raf表达水平较正常子宫肌层、在位内膜表达水平均明显升高,子宫腺肌病子宫组织中Ras、Raf总体表达水平较正常子宫组织亦明显升高.2、子宫腺肌病与正常子宫组织P-C-Raf的表达：子宫腺肌病在位内膜P-C-Raf表达水平较异位病灶组及正常子宫内膜组高,差异有统计学意义(P<0.05)；子宫腺肌病异位病灶、正常子宫肌层、正常子宫内膜之间P-C-Raf表达水平无明显差异(P>0.05)；子宫腺肌病在位内膜组与正常子宫肌层组P-C-Raf表达水平无明显差异(P>0.05)。3、FTS+E2 (Ras抑制剂+雌二醇)组细胞抑制率较FTS (Ras抑制剂)组高(P<0.05)；ICI182780(ER抑制剂)组及ICI182780+E2组均能抑制子宫腺肌病病灶细胞增殖,两组之间抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。雌激素剥夺组与雌激素剥夺+ICI182780组均能抑制子宫腺肌病病灶细胞增殖,雌激素剥夺+ICI182780组细胞抑制率较雌激素剥夺组高,差异有统计学意义(P<0.05)。雌激素激活状态能促进子宫腺肌病病灶细胞增殖；E2(雌激素激活状态)组能明显提高子宫腺肌病病灶细胞miR-21表达水平,与ICI182780+E2组及对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；ICI182780+E2组与对照组相比,子宫腺肌病病灶细胞miR-21表达水平无明显差异(P>0.05)。雌激素剥夺+ICI182780组子宫腺肌病病灶细胞miR-21表达水平最低,与雌激素剥夺组及对照组相比有统计学意义(P<0.05),4、加味芍药甘草汤、含药血清及其单体对人子宫腺肌病病灶细胞增殖抑制与凋亡的影响：加味芍药甘草汤高低浓度组24h及48h、加味芍药甘草汤含药血清组、米非司酮组(24h和48h,下同)、芍药苷高低浓度组24h、芍药苷甘草苷高低浓度组24h均能提高子宫腺肌病病灶细胞的凋亡率(P>0.05)；除甘草苷高浓度组24h组、空白血清组24h及48h外,其余各组均能明显抑制细胞增殖,其中加味芍药甘草汤高浓度48h的细胞增殖抑制率及细胞凋亡率最高,除与加味芍药甘草汤高浓度24h相比无统计意义外,均高于其他各组；加味芍药甘草汤含药血清组24h对细胞凋亡率的影响优于加味芍药甘草汤含药血清组48h及米非司酮组24h及48h,与加味芍药甘草汤高低浓度组24h、加味芍药甘草汤低浓度组48h、芍药苷高浓度组24h、芍药苷甘草苷高浓度组24h相持平；并发现米非司酮组24h对细胞凋亡率的影响明显高于芍药苷高低浓度48h、甘草苷高低浓度48h、芍药苷甘草苷高低浓度48h；而加味芍药甘草汤含药血清组、米非司酮组、芍药苷高低浓度组48h、芍药苷高浓度组24h、甘草苷低浓度组48h、芍药苷甘草苷高浓度组48h对细胞增殖抑制率影响相一致。药物干预时间点为24h各组之中,加味芍药甘草汤高浓度组与加味芍药甘草汤含药血清组对细胞凋亡率影响明显高于其余各组；在对细胞增殖抑制方面,加味芍药甘草汤高浓度组影响最大,各单体高低浓度之间细胞增殖抑制率无差别。药物干预时间点为48h各组之中,加味芍药甘草汤高浓度组对细胞凋增殖抑制率及亡率影响最高；加味芍药甘草汤含药血清组、芍药苷高低浓度组、芍药苷甘草苷高低浓度组各组48h对细胞凋亡率影响劣于24h。在细胞增殖抑制率方面,芍药苷低浓度组24h与48h相一致。5、加味芍药甘草汤含药血清组能明显降低人子宫腺肌病病灶细胞E2、RaS、Raf表达水平,24h组能降低人子宫腺肌病病灶细胞ER表达水平,与米非司酮组相比差异有统计学意义(P<0.05),加味芍药甘草汤含药血清组、米非司酮组均能明显降低人子宫腺肌病病灶细胞P450arom表达水平(P<0.05),加味芍药甘草汤含药血清组24h效果最好,与其他各组相比有明显差异(P<0.05)；各组中药单体明显降低人子宫腺肌病病灶细胞ER、P450arom、Ras水平,芍药苷高低浓度、芍药苷甘草苷高浓度降低ER作用最好；药苷高浓度组24h、芍药苷低浓度组24h、芍药苷甘草苷高浓度组24h、芍药苷甘草苷低浓度组48h降低Ras水平效果最好,与其他各组相比有统计学意义(P<0.05)；甘草苷高低浓度组、芍药苷甘草苷高低浓度组降低Raf水平效果最好,米非司酮组无此作用；加味芍药甘草汤高低浓度组均能降低人子宫腺肌病病灶细胞ER、P450arom、Ras、Raf表达水平,效果优于米非司酮组；加味芍药甘草汤高低浓度组、米非司酮组均不能降低人子宫腺肌病病灶细胞E2表达水平。6、加味芍药甘草汤及含药血清对人子宫腺肌病病灶细胞P-C-Raf表达的影响：在加味芍药甘草汤高浓度组、加味芍药甘草汤含药血清组、米非司酮组和空白对照组中,加味芍药甘草汤高浓度组48h与其他各组比较,能明显降低细胞P-C-Raf表达水平(P<0.05)；其余各组与空白对照组相比不能明显降低细胞P-C-Raf表达水平(P>0.05)。7、加味芍药甘草汤及含药血清对人子宫腺肌病病灶细胞miR-21表达的影响：加味芍药甘草汤高低浓度组、加味芍药甘草汤含药血清组48h、米非司酮组、空白对照组之中,加味芍药甘草汤高浓度组、米非司酮组24h、加味芍药甘草汤低浓度组48h之间无明显统计学意义(P>0.05),与其他各组相比均能明显降低子宫腺肌病病灶细胞miR-21表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1. E2、FR、P450arom、Ras/Raf/P-C-Raf在子宫腺肌病中表达升高,MiR-21在子宫腺肌病子宫组织与正常子宫组织中均有表达,两者之间表达水平无明显差异。E2与ER相结合发挥生物学效应,E2可通过Ras/Raf信号通路的介导作用促进子宫腺肌病病灶细胞增殖。E2、ER上调子宫腺肌病病灶细胞miR-21表达水平,ER为影响miR-21表达水平的主要因素,E2通过与ER相结合影响miR-21表达。2、ER及miR-21介导的Ras/Raf/P-C-Raf信号通路主要通过以下几方面参与子宫腺肌病的发生发展：①P450arom与E2存在正反馈机制,E2与ER结合启动基因效应,诱导靶基因改变,促进细胞增殖,参与子宫腺肌病的发展；②雌激素通过与膜受体结合激活Ras/Raf/P-C-Raf信号通路,磷酸化核内转录因子fos、jun及NF-κβ等,引起细胞异常增殖而诱发疾病；③雌激素及其受体上调miR-21,激活Ras/Raf/MAPK信号通路下游相关因子,参与子宫腺肌病的发生发展。3、加味芍药甘草汤、含药血清及其单体可能通过抑制子宫腺肌病病灶细胞增殖、诱导其凋亡而促进子宫腺肌病病病灶缩小甚或消退,发挥对子宫腺肌病痛经的治疗效应。其中加味芍药甘草汤高浓度组作用效果最好,作用效果呈浓度依赖性；其次为加味芍药甘草汤低浓度及其含药血清组,而各单体的总体效果最小,说明加味芍药甘草汤通过其配伍成分中各中药单体多靶点、多途径的综合作用有效地治疗子宫腺肌病。下一步实验可进一步筛选中药单体干预子宫腺肌病病病灶细胞的浓度。4、加味芍药甘草汤含药血清、中药单体、加味芍药甘草汤水提液均能明显降低人子宫腺肌病病灶细胞ER、 P450arom、Ras、Raf表达水平,效果优于米非司酮。加味芍药甘草汤含药血清组能明显降低子宫腺肌病病灶细胞E2水平,通过抑制E2与P450arom之间的正反馈环路,阻断E2经典途径及非经典途径生物学效应,抑制血管新生,发挥治疗子宫腺肌病及痛经作用。加味芍药甘草汤及其单体对E2水平无明显抑制作用,推断其可能通过降低ER水平,阻断E2与ER结合启动的基因组效应而起作用,同时抑制Ras/Raf信号通路,阻止血管新生而发挥作用。其中加味芍药甘草汤水提液中高浓度组效果最好,中药单体中芍药苷甘草苷高浓度效果最好。5、加味芍药甘草汤高浓度组48h可明显降低子宫腺肌病细胞P-C-Raf表达,阻断Ras/Raf信号通路而抑制子宫腺肌病的发生发展。6、加味芍药甘草汤高浓度组、米非司酮组24h、加味芍药甘草汤低浓度组48h均能阻断miR-21与Ras之间的正反馈,抑制Ras/Raf信号通路,促进子宫腺肌病异位病灶细胞凋亡,缩小病灶,抑制疾病发展。总体而言,加味芍药甘草汤通过干预ER与miR-21介导的Ras/Raf通路形成的信号交通网从多途径、多环节、多靶点对子宫腺肌病痛经患者起治疗作用。