单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因序列中最常见的变异，也是医学诊断或生物信息与疾病及药效关联的研究重点，对其研究有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应等，对其研究为新药开发和个体化医疗提供基础。这种分析常常需要对多样本多位点进行高通量并行分析，但国家缺少具有自主知识产权的技术平台，因此研发快速、准确、高通量且高灵活性的SNPs分析检测系统非常重要。　　 基于上述重大需求，在本论文中，我们将磁分离技术、磁性颗粒微阵列技术、单碱基延伸技术与自动磁分离工作站系统相结合，建立了一系列高通量、自动化、高特异性以及高实用性的单碱基差异检测新方法及辅助平台，并围绕着这一目的开展深入的应用基础研究。具体内容包括：　　 1.链亲和素修饰金磁纳米颗粒的制备　　 首先合成了包被有胶体金的金磁纳米颗粒(Gold coated magnetic nanopartieles，GMNPs)，然后，分别通过使用物理吸附与共价结合的方法制备链亲和素-金磁纳米颗粒。利用半胱胺(Cysteamine，CE)和11’巯基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic Acid,MUA)做为手臂分子在金磁复合颗粒表面共价修饰链亲和素。多种分析结果证明利用MUA和CE共价修饰的链亲和素-金磁纳米颗粒，链亲和素在其表面固定牢固，荧光背景低，生物相容性好，非常适用于免疫检测、核酸杂交等研究和实际应用。由于利用MUA作为手臂分子比CE捕获生物素标记的寡核苷酸序列更多一些，因此，利用MUA制各的链亲和素.金磁颗粒被优选用于构建磁性颗粒微阵列。　　 2.磁性颗粒微阵列与双色荧光杂交的核酸检测方法　　 在上述成功制备链亲和素修饰金磁纳米颗粒后，我们进一步提出了一种将金磁纳米颗粒与生物芯片相结合的磁性颗粒微阵列技术，并应用于核酸多态性分析。将DNA-金磁颗粒复合物点样到底部固定有磁铁的载玻片上构建磁性颗粒微阵列，通过双色荧光杂交进行核酸多态性分析。应用该方法成功地对来自24个样本的3个多态位点进行了分型，并将结果进行了验证。同时改进靶序列的扩增方法，即利用不对称PCR直接扩增出单链DNA，将捕获有单链DNA的金磁纳米颗粒复合物点样到固定有磁铁的载玻片上构建磁性颗粒微阵列，通过与双色荧光探针杂交实现了对样本的分型。由于避免了热变性的步骤，使得该方法能够适用于大多数商业化链亲和素-金磁颗粒与自动化工作站平台，将大大扩展该方法的应用范围。利用金磁纳米颗粒作为载体完成分型操作，该方法具有操作简单、快速等特点，同时还易于实现高并行、自动化样品的制备。通过磁性颗粒微阵列，我们还在同一个杂交框内实现了多样本的杂交反应，大大降低了杂交反应中对试剂与荧光检测探针的用量。　　 3.基于磁分离和延伸技术的单碱基差异检测　　 在上述研究基础上，我们进一步发展了将金磁纳米颗粒与单碱基延伸技术相结合的高通量单碱基差异检测方法。首先，将生物素标记的特异性延伸引物(Biotinylated extensionprimer,BioEP)固定在修饰有链亲和素的金磁纳米颗粒上，形成固相延伸引物。将包含有固相延伸引物、酶、靶序列以及荧光标记的特定ddNTP单体的延伸反应体系加入反应微孔板内进行单碱基循环延伸。反应后，纯合型样本只延伸上去一种荧光标记ddNTP，而杂合型样本延伸上两种不同的荧光标记ddNTP。最后将延伸有荧光单体的金磁纳米颗粒点样到载玻片表面构建“磁性颗粒微阵列”，通过检测颗粒表面荧光信号强度值确定样本的基因型。利用单色荧光标记的ddNTP进行延伸，我们对96个样本的4个位点进行了检测：接着我们又类似地利用双色荧光标记的ddNTP进行延伸并成功地对320个样本进行了检测。单碱基循环延伸方法的最大优点是避免了任何基于杂交技术SNP分型方法中，由于错配探针杂交产生的假阳性信号，因此具有极高的准确性，信噪比大于25。此外，我们将全基因组扩增与基于磁分离的单碱基延伸技术相结合，成功实现了对多样本多位点的同时检测。本文以磁性颗粒微阵列和单碱基延伸为基础，成功实现了多样本的在片延伸SNP检测，拓展了磁性颗粒微阵列的应用范围。　　 4.自动磁分离工作站　　 虽然本论文所研发的检测方法能够适用于各种商业化自动化检测平台，但鉴于目前自动化工作站的昂贵价格难以在各个实验室推广，为此，我们研发了同时具备磁分离功能和温控功能的简易自动磁分离工作站。该系统使用条形铷铁硼强磁体组成一定形状的磁铁阵列，通过步进电机控制螺旋丝杆来移动磁铁阵列以及市售96孔板的位置，使两者相嵌合，这时各个微孔内磁性纳米复合颗粒连带着其上特异性结合的生物大分子被吸附到微孔侧壁上。相比于将磁性纳米颗粒吸引沉降到微孔底部，这种设计更容易实现各个微孔内磁性颗粒复合体与未结合物质的同步分离与洗涤。同时使用半导体温控模块，实现了对微孔板的精确控温。利用该系统，结合本课题所提出并验证了的核酸检测方法，我们实现了对多样本的半自动检测。该系统结构简单、制造成本低、适用于各层次实验室，有利于本研究所开发的技术平台的推广。