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鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）也称鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）或鸭1型疱疹病毒（Anatid herpesvirus 1,AHV-1）,具有广泛的组织嗜性,是目前威胁和危害水禽养殖业健康发展的重要病原之一,但其感染机制尚未完全清楚。Cofilin是一种存在于真核细胞中的肌动蛋白解聚因子,调控细胞骨架的组装,参与细胞迁移、粘附、分裂和凋亡等生命活动。研究表明,cofilin调控的宿主细胞内肌动蛋白重排能影响病原体的感染过程。但目前尚未见到有关cofilin在DEV感染过程中作用及其分子机制研究的文献报道。因此,本研究拟在前期基础上,首先采用荧光定量PCR检测分析DEV感染对cofilin基因转录的影响,然后通过cofilin RNA干扰分析DEV增殖情况,以期为进一步阐明DEV致病机制提供重要的理论数据。1.鸭Cofilin2克隆分析及荧光定量PCR方法建立根据GenBank鸡源cofilin2基因（NM001004406.1）序列设计引物,RT-PCR方法扩增鸭源cofilin2全基因序列,生物信息学分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征;根据鸭源cofilin2全基因序列设计特异性引物,建立针对cofilin2基因FQ-PCR检测方法,结果显示:三穗麻鸭Cofilin2基因编码区为498bp,可编码166个氨基酸;其基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示Cofilin2在不同物种以及进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和延伸链为主,三级结构呈弯曲螺旋结构。以cofilin2基因质粒为标准品进行荧光定量PCR检测,发现扩增曲线Ct值与基因拷贝数呈良好的线性关系,PCR扩增曲线的标准方程为Y=-3.31x+38.29;该荧光定量PCR方法（FQ-PCR方法）最小检出量为1.0×102copies/μL,且具有良好的特异性。2.Cofilin在DEV感染鸭组织中的转录选取健康三穗鸭,人工感染DEV后,采集不同时间段感染鸭组织样本,提取样本总RNA,采用前期建立的FQ-PCR方法进行组织cofilin2基因转录水平检测,正常组和DEV感染组cofilin2基因在各组织转录的总体结果显示:在正常组,cofilin2在腿肌中的转录量最高,在心脏次之,在脾脏、法氏囊、胸腺最低;在DEV感染组,cofilin2在心脏中的转录量最高,在腿肌次之,在脾脏、法氏囊、胸腺中依旧最低。Cofilin2基因在同一组织不同时间段的DEV感染前后的转录变化结果显示:在心脏,感染组cofilin2转录量均高正常组,其中以72h时最为显著;在肝脏,除24h外,感染组cofilin2转录量均高于正常组,其中以48h时最为显著;在脾脏,除48h外,感染组cofilin2转录量均高于正常组,其中以72h时最为显著;在肺脏,除72h外,感染组cofilin2转录量均高于正常组,其中以24h时最为显著;在肾脏,感染24h和48h时感染组cofilin2转录量高于正常组,而感染72h和96h时低于正常组;在脑组织,感染组cofilin2转录量在24h时低于正常组,至48h和72h时高于正常组,待至96h时又低于正常组;在胸腺,感染组cofilin2转录量在不同时间段均高于正常组,其中以96h时最为显著;在十二指肠,感染组cofilin2转录量在24h和48h时高于正常组,至72h和96h时低于正常组;在法氏囊,感染组cofilin2转录量在24h至72h时均高于正常组,至96h时低于正常组;在腿肌,感染组cofilin2转录量在不同时间点均低于正常组,其中以48h时最为显著。由此可见,cofilin 2基因在DEV感染组的心脏和胸腺中的转录量在各时间点均高于正常组,在DEV感染组的腿肌中的转录量在各时间点均低于与正常组,其他组织中cofilin转录与DEV感染未呈现出一定的规律。3.基于Cofilin2基因的RNAi对DEV复制过程的影响根据上述测定的鸭源cofilin2全基因序列（GenBank序列号为MF434775）设计并构建干扰质粒cofilin-sh RNA-86、cofilin-sh RNA-247、cofilin-sh RNA-304和cofilin-sh RNA-451,分别转染鸭成纤维细胞,采用荧光显微镜和FQ-PCR方法筛选,然后选取抑制效率最高的干扰质粒cofilin-sh RNA-86,用以抑制鸭成纤维细胞cofilin2基因,再以FQ-PCR方法分析基于Cofilin2基因的RNAi对DEV复制过程的影响,结果显示:经转染DEF细胞,荧光显微镜观察4个干扰质粒均成功转染并得到表达;FQ-PCR方法检测证实,4个干扰质粒的沉默效率分别为54.02%、17.55%、41.12%和4.96%,其中以cofilin-sh RNA-86的沉默效率最高;经cofilin-sh RNA-86转染DEF细胞后48h、72h、96h、120h时沉默效率在42.59%56.23%;cofilin-sh RNA-86转染DEF细胞24h后感染DEV,检测DEV感染后24h、48h、72h、96h时DEV核酸量较转染DMEM组总体下降。综上所述,本实验成功测序获得鸭源cofilin2全基因序列;建立了针对cofilin2基因的FQ-PCR检测方法;正常组和DEV感染组各组织cofilin2基因在同一时间点的转录分别呈现基本一致的变化趋势,cofilin 2基因在同一组织的不同时间段的转录变化未呈现出一定的规律性;筛选得到了具有明显沉默效应的cofilin-sh RNA-86;通过干扰宿主细胞cofilin2基因表达,可显著促进DEV增殖。