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目的:目前中国糖尿病患者人数高达1.14亿,居世界首位。糖尿病作为一种慢性代谢性疾病可引起多种眼部并发症,约50%糖尿病患者合并干眼(有或无症状)和原发性角膜病变。糖尿病相关干眼表现为泪液分泌异常,泪膜稳定性下降,眼表的炎症损伤及角膜知觉减退等。糖尿病角膜病变以角膜上皮损伤后修复延迟或不愈合,角膜神经损害为主要特点,持续的角膜上皮缺损可继发角膜感染、角膜溃疡和角膜穿孔等并发症,严重危害患者视力。目前糖尿病相关干眼和糖尿病角膜病变的发病机制尚不明确,临床上缺乏行之有效的治疗策略。线粒体内活性氧簇(ROS)产生过多造成的氧化应激是引起糖尿病并发症共同的发病机制。线粒体靶向抗氧化剂特异性针对线粒体通过淬灭线粒体内的ROS发挥抗氧化作用,在糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等与氧化应激相关疾病的动物模型中表现出良好的疗效。但目前对糖尿病相关干眼及糖尿病角膜病变的作用尚不清楚,因此本课题以腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠为实验模型,探讨线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠干眼及角膜病变的作用及相关机制。方法:1.STZ诱导的1型糖尿病小鼠相关干眼的综合评价(1)STZ诱导的1型糖尿病小鼠干眼相关指标的评价及泪腺形态观察通过比较1型糖尿病小鼠和同龄正常C57BL/6J小鼠在血糖、体重、泪液分泌量、角膜虎红染色、泪液蕨类试验、结膜杯状细胞密度、角膜敏感度、角膜上皮细胞角蛋白10(K10)、泪腺重量、睑板腺脂质含量等方面的差异,对糖尿病小鼠相关干眼进行系统评价。(2)STZ诱导的1型糖尿病小鼠泪腺氧化应激状态的评价通过HE染色、Masson染色和免疫荧光等方法观察糖尿病小鼠泪腺发生的病理性改变;通过免疫组化、Western Blot等方法分别检测糖尿病和正常对照小鼠泪腺组织线粒体DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G),抗氧化酶Mn SOD、NQO-1、Catalase等表达的差异;使用化学发光法检测糖尿病和正常对照小鼠泪腺组织ATP水平差异;以评价糖尿病小鼠泪腺的氧化应激状态。(3)糖尿病小鼠泪腺组织AGEs/RAGE的表达及衰老相关的检测通过免疫组化、免疫荧光及Western Blot等方法检测糖尿病小鼠泪腺糖基化终末产物(AGEs)、糖基化终末产物受体(RAGE)的表达;采用冰冻切片衰老相关β-gal染色法和实时定量RT-PCR分别检测泪腺衰老程度和衰老相关基因p16及p53的表达差异。2.线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠干眼的作用(1)线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠干眼相关指标的影响以STZ诱导的1型糖尿病小鼠作为干眼模型,以免疫抑制剂0.05%环孢素(Cs A)滴眼液治疗为阳性对照,分别于点眼治疗1周、2周及3周时观察线粒体靶向抗氧化剂SS-31(10mg/ml)和Sk Q1(0.155μg/ml)对糖尿病小鼠角膜虎红染色、泪液分泌量、角膜敏感度等的影响。采用PAS染色方法观察SS-31和Sk Q1点眼治疗3周后对糖尿病小鼠结膜杯状细胞密度的影响。(2)线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠泪腺病理及超微结构的影响采用HE染色、CD45免疫荧光等方法观察SS-31和Sk Q1治疗3周后对糖尿病小鼠泪腺组织中炎细胞浸润程度的影响;通过透射电镜观察SS-31点眼治疗对糖尿病小鼠泪腺超微结构的影响。3.线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠角膜病变的影响(1)线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合的影响以STZ诱导的1型糖尿病小鼠和正常C57BL/6J小鼠为动物模型,刮除角膜上皮(中央直径3.0mm),通过角膜荧光素钠染色比较上皮刮除术后24h、48h及72h角膜上皮愈合的情况。并于上述时间点取角膜组织,行免疫荧光染色检测8-OHd G表达。刮除糖尿病小鼠角膜上皮(中央直径3.0mm),结膜下注射线粒体靶向抗氧化剂Mn TBAP及SS-31,观察其对角膜上皮损伤后愈合速度的影响。角膜上皮刮除72h后取角膜组织,以ROS、GSH染色检测氧化应激状态;免疫荧光检测8-OHd G的表达,Mn SOD、NQO-1、Catalase等抗氧化酶的表达,以及p-AKT、Sirt1、p-EGFR和Ki67等与角膜上皮损伤修复相关信号通路蛋白的表达。以小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)细胞为体外模型,以8-OHd G免疫荧光染色观察Mn TBAP对高糖环境下培养的TKE2细胞线粒体DNA稳定性的影响;通过流式细胞术检测Mn TBAP对高糖环境下的TKE2细胞内ROS累积的影响及JC-1染色检测线粒体膜电位的变化。(2)线粒体靶向抗氧化剂对糖尿病小鼠角膜神经修复的影响刮除糖尿病小鼠和正常小鼠角膜上皮(中央直径2.0mm),7天后取全角膜进行铺片行神经染色,观察线粒体靶向抗氧化剂Mn TBAP及SS-31对角膜神经纤维再生的影响,并追踪角膜上皮刮除前后角膜敏感度的变化。结果:1.STZ诱导的1型糖尿病小鼠相关干眼的综合评价(1)STZ诱导的1型糖尿病小鼠干眼体征明显,泪腺萎缩与正常对照小鼠相比,糖尿病小鼠血糖显著升高(P<0.001),体重显著下降(P<0.001)。糖尿病小鼠泪液分泌量显著减少(P<0.001),泪液蕨样结晶明显减少或消失;角膜虎红染色评分显著增加(P<0.001),角膜上皮K10表达增加;结膜杯状细胞密度显著下降(P<0.001);角膜敏感度下降(P<0.001),上皮下神经纤维密度降低。糖尿病小鼠泪腺萎缩,重量下降,泪腺重与体重比值显著低于正常对照(P<0.001)和睑板腺缺失鼠(Tabby小鼠)泪腺重与体重比值(P<0.01)。糖尿病小鼠睑板腺脂质含量与正常对照鼠差异不明显。(2)STZ诱导的1型糖尿病小鼠泪腺出现氧化应激损伤HE染色显示糖尿病小鼠泪腺出现大量的炎细胞浸润和CD45免疫荧光结果一致。Masson染色显示糖尿病小鼠泪腺腺泡间质及导管周围胶原纤维表达较正常小鼠增加,与α-SMA免疫荧光染色结果相符。免疫组化染色显示糖尿病小鼠泪腺8-OHd G表达显著增加,化学发光法检测泪腺组织ATP水平显著下降(P<0.01)。Western Blot结果显示糖尿病小鼠泪腺抗氧化酶Mn SOD、NQO-1、Catalase在蛋白水平表达均较正常对照小鼠显著降低(P<0.05)。(3)STZ诱导的1型糖尿病小鼠泪腺AGEs/RAGE表达增加,衰老程度加重免疫组化、免疫荧光染色及Western Blot结果示糖尿病小鼠泪腺中出现AGEs累积,其受体RAGE表达增加。实时定量RT-PCR结果显示衰老相关基因p16及p53在糖尿病小鼠泪腺中表达显著增加(P<0.05),与衰老相关β-gal染色结果一致。2.线粒体靶向抗氧化剂改善糖尿病小鼠干眼(1)线粒体靶向抗氧化剂改善糖尿病小鼠干眼表现SS-31组和Sk Q1组糖尿病小鼠局部点眼治疗1-3周各时间点角膜虎红染色评分显著低于PBS溶剂对照组(P<0.05),而Cs A组治疗3周时角膜虎红染色评分始较PBS对照组下降(P<0.05)。SS-31组和Sk Q1组小鼠泪液分泌量在1-3周各个时间点均高于PBS溶剂对照组(P<0.05);Cs A组治疗2、3周时泪液分泌量始较PBS溶剂对照组改善(P<0.05)。SS-31组和Sk Q1组小鼠在1-3周各个时间点角膜敏感度均高于PBS溶剂对照组(P<0.05);Cs A组角膜敏感度无明显变化。PAS染色显示SS-31组(P<0.01)、Sk Q1组(P<0.05)及Cs A组(P<0.05)治疗3周后结膜杯状细胞密度均较PBS对照组显著增加。(2)线粒体靶向抗氧化剂减轻糖尿病小鼠泪腺炎性改变,改善线粒体结构状态HE染色和CD45免疫荧光结果显示:SS-31组、Sk Q1组和Cs A组泪腺组织中炎细胞浸润程度减轻。透射电镜结果显示:SS-31干预可以增加糖尿病小鼠泪腺腺泡细胞内分泌颗粒数量,并改善线粒体结构形态。3.线粒体靶向抗氧化剂促进糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复(1)线粒体靶向抗氧化剂促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复与正常对照小鼠相比,糖尿病小鼠角膜上皮刮除48h及72h其愈合速度显著延迟(P<0.001)。免疫荧光染色显示糖尿病小鼠角膜上皮细胞修复过程中8-OHd G持续高表达;高糖环境下TKE2细胞8-OHd G亦表达增加。结膜下注射Mn TBAP和SS-31显著促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复(P<0.001)、并降低角膜上皮ROS水平和8-OHd G表达,提高GSH水平及Mn SOD,NQO-1,Catalase等抗氧化酶的表达,且角膜上皮细胞p-AKT、Sirt1、p-EGFR、Ki67的表达上调。Mn TBAP处理显著抑制高糖环境下TKE2细胞8-OHd G表达,并显著降低高糖处理后TKE2细胞内ROS的累积(P<0.001),抑制高糖环境下TKE2细胞线粒体膜电位的降低(P<0.001)。(2)线粒体靶向抗氧化剂促进糖尿病小鼠角膜神经损伤修复糖尿病小鼠角膜上皮刮除后,结膜下注射Mn TBAP和SS-31显著促进角膜上皮下神经纤维再生(P<0.05)及角膜神经敏感度的恢复(P<0.01)。结论:1.STZ腹腔注射诱导的1型糖尿病小鼠主要表现为泪腺萎缩,泪液分泌量下降、角膜虎红染色着色程度加重,结膜杯状细胞密度下降,角膜敏感度下降等,这与临床糖尿病干眼表现相似,因此可作为糖尿病相关干眼基础研究的动物模型。2.糖尿病小鼠泪腺线粒体DNA氧化损伤标志物8-OHd G表达增加,抗氧化相关酶表达减少、ATP水平下降,炎细胞浸润明显,泪腺组织衰老程度加重,提示高糖引起的氧化应激可能参与糖尿病相关干眼的发生,并加速了泪腺衰老的发生。3.线粒体靶向抗氧化剂SS-31和Sk Q1对STZ诱导的糖尿病小鼠干眼有一定的治疗作用。能够改善泪液分泌量、增加结膜杯状细胞密度、改善角膜敏感度以及泪膜稳定性,并减轻泪腺炎细胞浸润程度。其发挥作用可能与改善泪腺腺泡细胞线粒体结构形态和功能有关。4.线粒体靶向抗氧化剂Mn TBAP和SS-31干预可促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复和角膜神经纤维的再生及角膜敏感度的恢复;改善角膜上皮线粒体DNA稳定性和减轻氧化损伤,其作用机制可能与p-AKT及Sirt1表达上调有关。创新和意义1.首次发现链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠泪腺重量与体重比显著低于正常对照小鼠及睑板腺缺失Tabby鼠(蒸发过强型干眼动物模型),泪腺明显萎缩,提示糖尿病相关干眼的发病机制不同于其他类型干眼。2.首次发现链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠角膜上皮和泪腺线粒体DNA氧化损伤,以此为靶点,采用线粒体靶向抗氧化剂进行干预治疗,可减轻糖尿病小鼠相关干眼表现,并促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复和神经再生,为糖尿病相关干眼和角膜病变的临床治疗提供了潜在的治疗策略和新的靶点。