胶质母细胞瘤呈侵袭性生长是其最突出的生物学特征,其导致肿瘤的迁移和复发,也是导致胶质瘤患者死亡的重要原因[1]。研究发现,恶性肿瘤迁移播散过程中,具有侵袭性的肿瘤细胞形成一种肌动蛋白聚合骨架的细胞膜性突起,这种结构能够募集包括基质金属蛋白酶(MMPs)在内的多种蛋白酶至细胞-基质接触部位,降解细胞周围基质以消除肿瘤细胞转移障碍,从而实现侵袭性肿瘤细胞的侵袭和迁移,进而导致肿瘤的播散。恶性肿瘤细胞中的这种特殊的肌动蛋白骨架结构称为侵袭性伪足(invadopodia)[2]。侵袭性伪足因在肿瘤细胞的侵袭迁移过程中发挥重要作用而受到关注[3]。在侵袭性伪足的形成过程中,皮层肌动蛋白(cortactin)的磷酸化过程是侵袭性伪足成熟和功能发生的关键[4]。Src作为最早发现的癌基因之一,最早被发现其能够磷酸化cortactin从而诱导侵袭性伪足的成熟和功能[5]。然而,最近研究表明,另一种非受体酪氨酸激酶Arg作为Src的下游调节因子,在Arg的Y439磷酸化域能够被激活的Src活化,磷酸化激活的Arg同样能够磷酸化激活cortactin,而且Arg可能在cortactin的磷酸化过程中发挥更为重要的作用[6]。首先,有研究表明,在cortactin的磷酸化激活过程中,Arg较Src对于cortactin具有更强的亲和力[7],可能发挥着更为重要的磷酸化激活作用;其次,在表皮生长因子(EGF)等诱导作用下,Arg的Y272磷酸化域能够实现自磷酸化,其自磷酸化过程不受上游调节因子Src影响,部分磷酸化的Arg对于cortactin也具有一定的磷酸化激活效应[8]。磷酸化的Src能够将Arg的另一磷酸化位点Y439磷酸化,完全磷酸化的Arg具有完全的磷酸化激活cortactin的活性[6]。在乳腺癌[9]、肝癌[10]、肺癌[11]、胃癌[12]等实体肿瘤中的研究发现,Arg在肿瘤细胞的侵袭运动功能中具有调节作用。乳腺癌中的相关研究表明,Arg可能在乳腺癌的增殖与侵袭表型转换过程中发挥重要的调控作用,其表达量的变化能够调节乳腺癌的增殖和迁移能力,并且其增殖和迁移能力随Arg表达量的增高呈现相反的变化趋势[9]。总之,以往研究表明,Arg在cortactin的磷酸化激活过程可能发挥较Src更为关键的作用。已有研究表明cortactin的磷酸化过程在侵袭性伪足的形成过程中具有重要意义,这就意味着Arg在肿瘤细胞侵袭性伪足的成熟和功能发生II过程中可能发挥重要作用。在胶质瘤中,肿瘤细胞表达趋化因子受体CXCR4,能够与基质细胞产生的CXCL12(又称基质细胞衍生因子1,SDF-1)特异性结合,诱导肿瘤细胞趋向性侵袭运动,从而导致肿瘤的趋向性迁移运动[13]。有研究表明,CXCL12能够诱导肿瘤细胞基质金属蛋白酶的分泌[1]。结合我们之前研究,我们推断CXCL12/CXCR4可能是通过对Arg-cortactin通路促进侵袭性伪足成熟和功能发生,从而诱导肿瘤侵袭迁移过程。本课题主要研究Arg在CXCL12/CXCR4诱导的胶质瘤细胞侵袭运动中的作用及其潜在的调节机制,研究分为以下四个部分:1.观察CXCL12/CXCR4对胶质瘤细胞侵袭迁移运动的影响。通过Transwell侵袭实验,宏观观察CXCL12/CXCR4在肿瘤细胞侵袭迁移运动中的作用。通过荧光基质胶降解实验,微观观察CXCL12/CXCR4对胶质瘤细胞侵袭性伪足形成和荧光基质胶降解的影响。通过Western blotting,观察CXCL12/CXCR4对cortactin磷酸化水平的影响,探讨CXCL12/CXCR4诱导肿瘤细胞侵袭的作用机制。实验结果显示,与对照组比较,在加入诱导因子CXCL12处理后,胶质瘤细胞的侵袭迁移能力显著升高,肿瘤细胞侵袭性伪足形成和基质胶降解能力明显增加,cortactin磷酸化水平显著增高。同时,与对照组比较,加入CXCR4特异性抑制剂AMD3100组的胶质瘤细胞侵袭迁移运动能力显著降低,肿瘤细胞侵袭性伪足形成和基质胶降解能力明显减少,cortactin磷酸化水平显著降低。这表明,CXCL12/CXCR4轴可能正是通过调节cortactin的磷酸化水平从而影响侵袭性伪足的形成,进而导致趋向性侵袭运动发生。2.观察Arg蛋白对胶质瘤细胞侵袭迁移运动的影响。我们利用慢病毒转染,建立了Arg蛋白稳定低表达的胶质瘤细胞系。利用Transwell侵袭实验、荧光基质胶降解实验,观察敲Arg对胶质瘤细胞侵袭迁移运动的影响;Western blotting观察敲Arg对cortactin磷酸化水平的影响;免疫荧光和免疫共沉淀实验观察Arg在胶质瘤细胞中与cortactin的共定位和结合情况。研究分为三个实验组,首先建立Arg稳定低表达的U87胶质瘤细胞作为sh RNA-Arg组(n=3),同时设置sh RNA-NC(阴性对照组,n=3)组和sh RNA-N(空白对照,n=3)组。实验结果显示,sh RNA-Arg组与对照组相比,胶质瘤细胞侵袭迁移能力显著降低,侵袭性伪足形成和基质胶降解能力减少。进一步实验表明,免疫荧光实验显示Arg与cortactin共定位于细胞伪足,免疫共沉淀实验显示在胶质瘤细胞中Arg与cortactin之间存在直接结合作用关系。Arg蛋白稳定低表达的胶质瘤细胞中cortactin磷酸化水平显著降低。这表明,Arg在胶质瘤细胞的侵袭运动过程中具有调控作用,能够影响细胞侵袭性伪足的形成和功能,该作用可能是通过调节cortactin磷酸化水平实现的。3.CXCL12/CXCR4通过Arg调节肿瘤细胞的侵袭迁移运动。此前研究表明,CXCL12/CXCR4与Arg蛋白对胶质瘤侵袭过程中均发挥调节作用,并且其调节过程都是通过调节cortactin的磷酸化水平从而调节侵袭性伪足形成发挥作用的。据此,我们猜想CXCL12/CXCR4是否通过Arg调节胶质瘤细胞的侵袭运动。为验证Arg在CXCL12/CXCR4诱导胶质瘤细胞侵袭运动过程中的作用,研究分为三个实验组,分别为Arg KD(Arg稳定低表达的胶质瘤细胞)+CXCL12组、Arg KD+PBS组和Arg NC(Arg表达未敲低的胶质瘤细胞)+CXCL12组。利用Transwell侵袭实验和荧光基质胶降解实验,观察不同处理对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。Western blotting观察各处理组cortactin磷酸化水平的差异。实验结果显示,与Arg表达未敲低的胶质瘤细胞相比,CXCL12对Arg蛋白稳定低表达的胶质瘤细胞的诱导肿瘤细胞侵袭迁移的能力显著降低,诱导肿瘤细胞生成侵袭性伪足的能力显著下降,同时,CXCL12不能够诱导Arg蛋白稳定低表达的胶质瘤细胞内cortactin磷酸化水平升高(P<0.05);Arg KD+CXCL12组与Arg KD+PBS组相比,胶质瘤细胞的侵袭迁移能力、侵袭性伪足形成和基质胶降解能力以及cortactin磷酸化水平差异不显著(P>0.05)。结论:1.CXCL12/CXCR4能够调节胶质瘤细胞的侵袭迁移能力,并且该过程可能是通过调节cortactin的磷酸化实现的。2.Arg能够调节cortactin的磷酸化水平进而调控胶质瘤细胞的侵袭运动。3.CXCL12/CXCR4通过Arg-cortactin通路调节胶质瘤细胞侵袭性伪足形成和基质降解能力,从而调节胶质瘤细胞的侵袭迁移。