【摘 要】
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α-淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷葡萄糖苷水解酶,EC3.2.1.1)能够以淀粉为底物,从淀粉内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键,广泛应用于淀粉糖生产、发酵、纺织、造纸等许多行业,具有巨大
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α-淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷葡萄糖苷水解酶,EC3.2.1.1)能够以淀粉为底物,从淀粉内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键,广泛应用于淀粉糖生产、发酵、纺织、造纸等许多行业,具有巨大的经济价值.
我们从新疆火焰山的土壤中分离出了一株能降解淀粉的菌株B-10,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对其分泌的α-淀粉酶(AMY-1)进行了分离和纯化以及酶学性质研究.该酶分子量为65kD,以可溶性淀粉为底物,最适反应温度为70℃,最适反应pH为5.5,具有很好的热稳定性和pH稳定性,对大多数金属离子和化学试剂不敏感.
根据α-淀粉酶基因保守区序列设计合成了引物,以B-10基因组:DNA为模板,通过PCR的方法得到了α-淀粉酶基因(amy).编码基因全长1980bp,有一个开放阅读框,编码660个氨基酸,其中前32个氨基酸残基为信号肽序列.与GenBank中已报道的α-淀粉酶基因进行了比较,发现基因序列相似性为最高为92﹪.将克隆得到的带有信号肽编码序列的α-淀粉酶基因(amy).与载体pET-30a构建重组表达质粒pET-amy,得到的表达产物具有正常的生物学活性.
随后我们克隆B-10自身的α-淀粉酶启动子,并验证其具有启动子功能.将启动子序列和α-淀粉酶基因序列连入穿梭质粒载体pUBC-19并转入枯草芽孢杆菌WB800中进行表达,获得工程菌株WB800-1＃,通过酶活力测定和SDS-PAGE电泳证实α-淀粉酶基因在WB800中获得表达,并且表达量比原菌高28倍.
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