实验目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以关节功能障碍和关节软骨退变为特征的疾病,是一种关节持续疼痛为特点的慢性关节疾病.在OA发生和进展中,炎症因子起到至关重要的作用.作为在OA进展中相当重要的炎症因子,IL-1β被广泛地用于OA体外微环境的模拟.关节软骨由软骨细胞和细胞外基质(ECM)组成.软骨细胞负责ECM的产生和维持,是关节软骨的唯一分化细胞.其中软骨细胞的分化程度较高,自身增殖、再生能力较差.而软骨细胞的生理作用主要为合成与分泌软骨细胞外基质与代谢相关的蛋白,同时负责维持细胞外基质的新陈代谢生理平衡.细胞的炎症反应与软骨细胞肥大均在OA的疾病发生和发展中起到了至关重要的作用.对于OA的治疗,临床上通常是以控制疼痛和消除关节肿胀等症状来延缓OA的病情进展,而阶梯化、个体化治疗也纳入了最新的治疗方案.现今已有许多治疗OA的药物面世,并且已用投入临床使用.例如临床上常用的非甾体类消炎药(NSAIDs)、氨基葡萄糖类药物、透明质酸钠以及硫酸软骨素类药物等.目前指南上建议的药物只能改善或缓解OA的临床症状,并不能阻止OA的病理进展.三白草酮(Sauchinone,SAU)是我国中药三白草主要成分之一,有研究发现三白草酮具有一定的消炎、镇痛、氧化应激等其他的相关药理作用.三白草酮在OA治疗方面的应用尚未有过相关报道,本实验旨在探讨三白草酮对于OA是否具有治疗作用以及其作用的机制.
　　实验方法:在本研究中,实验使用小鼠软骨细胞作为小鼠关节炎的体外模型,以此检测了SAU对于小鼠OA的治疗效果.本实验通过使用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测了SAU对于软骨细胞的相对细胞毒性作用强度.利用ELISA等方法检测并分析了TNF-α,IL-6,NO和PGE2等炎症因子在小鼠软骨细胞中的相对表达量.使用Westernblot法检测INOS、COX-2、MMPs、AMAMTS-5等蛋白在软骨细胞中的表达程度的变化,与此同时检测分析了软骨肥大相关的蛋白COL-X、VEGF-A、RUNX-2和CollagenII的相对表达水平的变化.对于Nrf-2/HO-1/NF-κB信号通路相关蛋白(P65、p-IκB、Nrf-2和HO-1)在软骨细胞中的相关变化,实验同样使用了Westernblot法进行检测与分析.通过免疫荧光法检测NF-κB信号通路的核移位现象,并使用siRNA抑制Nrf-2表达验证了相关通路表达.除此之外,实验还制作了小鼠关节炎的动物体内OA模型,并使用S-O对关节组织进行染色处理评估,并以此进一步验证了SAU对于动物OA的具体的疗效.
　　实验结果:本实验中,实验证明了SAU可以由浓度依赖的方式上抑制由IL-1β诱导的小鼠软骨细胞分泌INOS、COX-2和MMP-13等蛋白的作用,并同时促进CollagenⅡ等软骨细胞外基质的合成与分泌.此外,实验还发现SAU可以抑制软骨肥大相关的蛋白如COL-X、VEGF-A和RUNX-2的相对表达.同时,SAU在软骨细胞上可以上调Nrf-2的表达,并产生相应的抗炎效果,在使用siRNA干扰Nrf-2基因之后,抗炎效果减弱.结果显示上述的实验结果产生的原因可能是因为SAU可以抑制由IL-1β介导的Nrf-2/HO-1/NF-κB信号通路的活化.在小鼠OA模型的体内实验中,实验同样发现并证明了SAU可以延缓小鼠OA的疾病进展程度.
　　实验结论:SAU抑制由IL-1β诱导的小鼠软骨细胞的炎症、基质分解与软骨肥大.SAU可以显著上调Nrf-2的细胞内表达,可以通过介导Nrf-2/HO-1/NF-κB信号通路的激活来调节OA中炎症介质及肥大相关蛋白的表达,从而起到治疗OA的作用.通过实验,我们认为以SAU或者其衍生物作为药物在应用于骨关节炎的治疗将拥有更加广阔的前景.