mGITRL转染Lewis细胞株的建立及生物学功能的初步研究

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目的:构建携带小鼠mGITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,建立稳定表达mGITRL的小鼠Lewis细胞株,并通过体内外功能实验,探讨mGITRL蛋白在肿瘤生物治疗中的作用。方法:(1)利用PCR方法,以mGITRL TA克隆为模板扩增mGITRL基因,将mGITRL基因克隆至pIRES2-eGFP载体,酶切筛选阳性克隆并进行序列测定。(2)将测序正确的pIRES2-eGFP/mGITRL载体通过电穿孔法(电压为0.22KV、电容为960μf)转染4.0×10~6Lewis细胞,转染后的细胞用800μg/ml G418筛选,并经过克隆化生长,获得稳定表达mGITRL的Lewis细胞株。(3)在抗CD3 mAb存在下,5.0×10~4丝裂霉素C处理过的Lewis、eGFP-Lewis、GITRL-Lewis细胞分别和5.0×10~4 CD4~+CD25~-T细胞,或CD4~+CD25~+T细胞加CD4~+CD25~-T细胞共培养,观察CD4~+CD25~-T细胞增殖能力和CD4~+CD25~-T细胞抑制功能。(4)2.0×10~6Lewis、eGFP-Lewis、GITRL-Lewis细胞分别致瘤,观察小鼠肿瘤的生长情况及小鼠生存率,并检测荷瘤小鼠CD4~+CD25~+T细胞比例,以及CD4~+CD25~-T细胞增殖能力和CD4~+CD25~+T细胞抑制功能。结果:(1)经PCR扩增获得目的基因,经酶切、连接,构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,酶切鉴定为阳性质粒,基因测序与GenBank中发表的序列(AY359852.1)完全一致。(2)测序正确的pIRES2-eGFP/mGITRL载体体外转染Lewis细胞,经G418筛选,克隆化生长,获得稳定表达细胞株,该细胞株经RT-PCR检测表达mGITRL,流式细胞仪检测表达EGFP和mGITRL。(3)体外共培养试验显示,在抗CD3 mAb刺激下,丝裂霉素C处理过的GITRL-Lewis能增加CD4~+CD25~-T细胞的增殖,并能部分解除CD4~+CD25~+T细胞的免疫抑制功能。(4)GITRL-Lewis组小鼠较eGFP-Lewis组及Lewis组小鼠肿瘤生长明显缓慢,生存率显著提高。(5)荷瘤小鼠的脾细胞中CD4~+CD25~+T细胞占CD4~+T细胞的比例无明显差异但高于正常小鼠。荷瘤小鼠的TIL细胞中CD4~+CD25~+T细胞占CD4~+T细胞的比例明显高于脾细胞,而GITRL-Lewis荷瘤小鼠的TIL细胞中CD4~+CD25~+T细胞的比例低于Lewis及eGFP-Lewis组小鼠。(6)荷瘤小鼠的免疫功能低下,其CD4~+CD25~-T细胞的增殖能力明显低于正常小鼠;但GITRL-Lewis组小鼠CD4~+CD25~-T细胞的增殖能力高于eGFP-Lewis组小鼠。荷瘤小鼠CD4~+CD25~+T细胞均能抑制正常小鼠CD4~+CD25~-T细胞增殖,但GITRL-Lewis荷瘤小鼠CD4~+CD25~+T细胞抑制正常小鼠CD4~+CD25~-T细胞增殖的作用低于eGFP-Lewis组。结论:(1)成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL。(2)建立了稳定表达mGITRL的Lewis细胞株。(3)GITRL-Lewis细胞能增强CD4~+CD25~-T细胞的增殖,部分解除Treg细胞的免疫抑制功能。(4)GITRL-Lewis细胞的致瘤能力明显低于野生型细胞株。
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