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研究背景： 骨肉瘤常发生肺转移，这使得彻底根除肿瘤变得尤为困难。 癌基因MYC过度表达是骨肉瘤发生发展的重要原因之一。有研究表明MYC等转录因子可以作用于miRNA的基因启动子区，从而调控其转录及表达水平。 通过诱导信使RNA的降解或后转录水平的翻译抑制，miRNA下调靶基因的表达。它在肿瘤的发生、发展和转归过程中均发挥着重要作用。前期，课题组通过对比具有不同转移潜能同源骨肉瘤细胞系F4与F5M2的miRNA表达谱，鉴定出一组与骨肉瘤转移相关的miRNA。本课题选择在 F5M2骨肉瘤细胞中相对低表达的miR-193b-3p作为研究对象。 作为肿瘤抑制剂，miR-193b-3p在其他肿瘤中已被多次报道。但在人骨肉瘤中，它扮演的角色尚未明了。miR-193b-3p在人骨肉瘤中有无表达异常？促癌还是抑癌？与其功能相关的下游调控机制是什么？在骨肉瘤细胞中有关miR-193b-3p基因表达调控的上游机制是什么？它是否参与了转录因子MYC表达异常诱发骨肉瘤的过程？本课题将依次对以上问题进行研究解答，阐明 miR-193b-3p在骨肉瘤发生发展中发挥的具体功能作用及其上下游分子机制，为骨肉瘤临床治疗开辟新思路。 目的： 研究miR-193b-3p对F5M2/F4骨肉瘤细胞恶性行为的影响；筛选并验证与F5M2/F4骨肉瘤细胞恶性行为相关的miR-193b-3p下游靶分子；鉴定miR-193b-3p是否参与MYC表达异常诱发骨肉瘤的过程，进一步完善骨肉瘤恶性行为的分子机制，为其临床靶向治疗提供新方向。 方法： 1.运用核酸实时定量技术，对比具有不同转移潜能的骨肉瘤细胞系 F5M2/ F4中miR-193b-3p的表达差异； 2.骨肉瘤细胞系F5M2/F4中分别转染miR-193b-3p mimic和miR-193b-3p inhibitor上/下调 miR-193b-3p的表达后，先进行 MTT实验、平板克隆形成实验、流式分析周期及凋亡来检测细胞恶性增殖及其克隆形成能力的变化，然后进行伤口愈合实验、Transwell实验来检测细胞迁移及转移潜能的变化； 3.通过慢病毒感染稳定上调F5M2中miR-193b-3p表达水平，随后进行裸鼠皮下荷瘤试验和肺转移形成实验，检测miR-193b-3p在体内对骨肉瘤形成及肺转移的作用； 4.通过多个miRNA靶基因预测网站分析miR-193b-3p的下游靶分子，筛选其中可能与肿瘤恶性行为相关的基因作为预测靶基因；将靶基因3’UTR区域克隆入PGL3-control-msc2报告基因载体，进行双荧光素酶报告基因实验验证该靶基因是否受miR-193b-3p的直接调节；瞬时转染上下调F5M2/F4中miR-193b-3p的表达水平后，通过实时定量和蛋白印迹实验检测靶基因的表达变化； 5.挽救实验证实miR-193b-3p通过抑制靶基因的表达来抑制骨肉瘤增殖和转移； 6.利用生物信息学网站分析可能调节miR-193b-3p表达的转录因子MYC；瞬时转染过表达质粒或siRNA下调/上调F5M2/F4中转录因子MYC的表达后，qRT-PCR检测miR-193b-3p的表达水平变化，分析miR-193b-3p表达是否受MYC影响； 7.克隆miR-193b基因表达启动子区域，连接至PGL3报告基因质粒，进行荧光素酶报告基因实验和CHIP实验进一步验证转录因子MYC是否通过与miR-193b-3p基因表达启动子区域直接结合从而下调miR-193b-3p表达水平； 8.在上下调miR-193b-3p后的F5M2/F4骨肉瘤细胞系中，通过qRT-PCR和WB技术检测miR-193b-3p是否可调节MYC表达水平；生物信息学预测MYC是否为miR-193b-3p的直接靶基因。 结果： 1.qRT-PCR分析结果显示，与侵袭能力相对弱的F4骨肉瘤细胞相比，miR-193b-3p在F5M2骨肉瘤细胞系的表达水平更低； 2.体外细胞功能学实验结果： 1）瞬时转染miR-193b-3p mimic显著上调F5M2骨肉瘤细胞中miR-193b-3p的表达后，MTT实验及克隆形成实验结果显示：相比于对照组，miR-193b-3p上调组骨肉瘤细胞增殖能力及克隆形成能力减弱；流式细胞周期及凋亡分析可见过表达miR-193b-3p组骨肉瘤细胞G1期细胞比例升高、进入S/G2期细胞比例降低，凋亡细胞百分比上升；伤口愈合实验可见miR-193b-3p上调组骨肉瘤细胞迁移能力比对照组弱，转移实验可见miR-193b-3p上调组通过Transwell小室膜转移到下室的骨肉瘤细胞数量明显减少、转移能力明显减弱； 2）瞬时转染miR-193b-3p inhibitor显著下调F4骨肉瘤细胞中miR-193b-3p的表达后，MTT实验及克隆形成实验结果显示：相比于对照组，miR-193b-3p下调组骨肉瘤细胞增殖能力及克隆形成能力增强，流式细胞周期及凋亡分析可见miR-193b-3p下调组骨肉瘤细胞G1期细胞比例降低、进入S/G2期细胞比例升高，凋亡细胞百分比下降；伤口愈合实验可见miR-193b-3p下调组骨肉瘤细胞迁移能力比对照组强，转移实验可见miR-193b-3p下调组通过Transwell小室膜转移到下室的骨肉瘤细胞数量明显增多、转移能力明显增强； 3.裸鼠进行皮下荷瘤试验发现，相比于对照组，注射高表达miR-193b-3p骨肉瘤细胞组裸鼠荷瘤体积小、肿瘤重量轻；肺转移实验发现裸鼠尾静脉注射骨肉瘤细胞后，注射高表达miR-193b-3p骨肉瘤细胞组裸鼠肺转移灶数目明显减少、体积明显变小； 4.生物信息学预测提示，KRAS可能为miR-193b-3p潜在的下游靶基因，qRT-PCR、Western blot和荧光素酶报告基因实验进一步证实KRAS确实为骨肉瘤细胞中miR-193b-3p直接调控的下游靶基因； 5.挽救实验证实miR-193b-3p通过抑制KRAS的表达发挥抑癌作用； 6.经生物信息学网站分析，miR-193b-3p的表达可能受转录因子MYC的调节。与miR-193b-3p的表达相反，骨肉瘤细胞F5M2中MYC表达明显高于F4；瞬时转染过表达质粒或siRNA下调/上调F5M2/F4中转录因子MYC的表达后，qRT-PCR检测miR-193b-3p的表达变化，发现相比于各自对照组，MYC上调组miR-193b-3p表达下降，MYC下调组miR-193b-3p反而升高；利用荧光素酶报告基因实验和CHIP实验进一步证实MYC通过与miR-193b-3p基因表达启动子区域直接结合，下调miR-193b-3p表达； 7.骨肉瘤细胞F5M2中过表达miR-193b-3p后，qRT-PCR及WB分析发现MYC表达下降；在F4细胞中下调miR-193b-3p后，MYC表达上调。 结论： 通过抑制KRAS基因，miR-193b-3p抑制F5M2/F4骨肉瘤细胞恶性行为；骨肉瘤细胞中miR-193b-3p与转录因子MYC间存在相互抑制作用。