研究背景骨质疏松症是当下社会最常见的骨骼系统疾病,是一个严重的公共健康问题。骨质疏松的特点就是全身性的骨量流失、骨微结构损伤、骨质量降低最终导致脆性骨折。年龄超过50岁的约20%的女性和7%左右的男性均患有骨质疏松症,而其中一半的人经历过骨质疏松性骨折,尤其是髋部、腕部和椎体部位的骨折。从细胞病理生理学的角度来讲,导致骨质疏松症的原因是破骨细胞的功能活性超过了成骨细胞的活性。传统意义上讲,骨质疏松症被认为是一种内分泌系统疾病(尤其是雌激素不足导致的继发性骨质疏松症);但是越来越多的研究证实慢性炎症性疾病(类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、克隆恩病、溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺病、特定病毒感染)与骨质疏松性骨折关系密切。临床实践和基础实验研究发现骨质疏松症和免疫系统介导的炎症状态之间有着紧密的联系,例如类风湿性关节炎,获得性免疫缺陷综合征,并且进一步发现一种更普通的炎症状态同样被确认为骨质疏松性骨折的病理性因素,像老龄化。在所有的情况下,导致骨组织病变的最主要的病理机制似乎就是炎症反应。从这个观点出发,可以认为骨质疏松症是一种免疫系统介导的疾病,发病过程是免疫激活,通过诱导产生细胞因子和炎症反应,导致破骨细胞和成骨细胞活性重构和骨转换的失调节,结果就是骨吸收活动增强从而产生骨质疏松症。骨组织和免疫系统通过复杂的自平衡网络达到功能上的整体性,并且从各个方面来讲,骨质疏松症可以被认定为一种慢性免疫系统介导的炎性疾病,因为骨质疏松症与临床上其它多种炎性疾病有相同的临床和生物学特征。经过近几年的努力,关于免疫系统和骨骼系统之间相互作用的认识得到明显提升;早在2000年,"骨骼免疫学"就已经被提出来了。自那时开始,骨骼免疫学越来越得到大家的重视,此领域的研究也变得越来越深入。因此骨免疫学已经明确了作为一个跨学科研究和临床领域,它可以对一些临床上常见病、多发病,例如骨质疏松症,对发病机理和临床症状进行全新的解释。与其相关的领域不断扩大,大大丰富了其转化领域的数量,尤其在临床实践和医学的不同分支。骨免疫学概念的重点放在桥接着两个器官系统的病理生理状态的原因上,包括骨质疏松症、老龄化、围绝经期、炎性关节炎、癌症、代谢障碍和神经失调症等。许多分子影响破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的平衡。成骨细胞可以分泌产生正性调节和负性调节破骨细胞生成的因子如RANKL和OPG。破骨细胞分化由RANKL与RANK结合启动。成骨细胞是产生RANKL的主要来源,但是骨细胞、成纤维细胞或者免疫系统也产生RANKL。通过RANKL信号通路,免疫系统激活后可以直接诱导破骨细胞生成和促进骨吸收活性。已经有研究证实了免疫细胞,像活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞,还有树突状细胞,都表达RANKL。甚之,RANKL刺激骨吸收活性的介质是NFATc1,而它是免疫系统调节的一个关键因子。定植于骨髓中的T淋巴细胞是调节骨重建的关键性免疫细胞,也是生理和病理条件下,骨细胞对甲状旁腺激素产生反应性的关键细胞。在炎症性疾病或者全身性的系统性炎症状态为特征的状态,像绝经期和老龄化,破细胞骨吸收是由活化的T淋巴细胞所驱动。然而,骨髓T细胞同样参与骨代谢平衡过程,通过诱导骨形成或者与骨细胞的直接的相互作用。两种机制牵涉其中,T细胞共刺激分子与它们骨细胞和前体细胞表面反受体的结合,成骨细胞系Wnt信号通路的活化释放Wnt配体和细胞因子。T淋巴细胞对骨组织的作用效果最终决定于它们的活化状态和它们特殊的基因型。不仅免疫系统可以调节骨重建,骨组织同样可以影响免疫系统,主动影响免疫细胞。相同的骨细胞可以影响甚至表现出许多免疫功能,就像细胞因子生产和抗原提呈作用。从此种意义上讲,骨组织可以被认为是一种广义上的免疫系统。骨细胞分泌产生的细胞因子可以促使原始T细胞分化成不同的细胞系,导致成熟T细胞的扩增,从而进一步调节骨代谢平衡。破骨细胞选择性募集和活化CD8+T细胞,表达CD25和FoxP3。反过来,这些CD8+T细胞抑制骨吸收,降低炎症或者破骨细胞生成细胞因子的生成,刺激骨形成,产生了一个调节环路:破骨细胞和RANKL诱导调节T细胞,调节T细胞使破骨细胞生成的骨吸收活动钝化。含氮双磷酸盐治疗骨质疏松症和Paget病的药物,还广泛应用于治疗和预防肿瘤相关的骨骼病变。唑来膦酸是一种侧链含有咪唑环的双磷酸盐,每年静滴一次,通过抑制骨吸收来提高骨密度。唑来膦酸已经在很多国家进入临床应用,用来治疗绝经后骨质疏松症,糖皮质激素诱导的骨质疏松症和老年性骨质疏松症。静脉应用唑来膦酸后的24-36小时内经常出现发热和全身肌肉骨骼酸痛,被称为急性期反应,原因可能与外周血中淋巴细胞暂时下降有关。目前已经证实的是急性期反应与γδT细胞的活化和致热细胞因子的释放有关。研究证实含氮双磷酸盐抑制法尼基焦磷酸合酶导致相邻的单核细胞内上游代谢产物聚集,包括异戊烯基焦磷酸酯等。静脉应用或口服含氮双磷酸盐会导致至少持续1年的γδT细胞的下降。并且证实静脉应用含氮双磷酸盐比口服用药γδT细胞的下降的程度更明显。近来临床研究发现哩来膦酸不仅仅影响γδT细胞,同样影响总白细胞、淋巴细胞、CD+T细胞和嗜酸性细胞。外周血循环中γδT细胞的持续下降可能有重要的意义。γδT细胞只是外周血中1-10%CD3+T细胞,它们在上皮组织中的表达更丰富些。外周血淋巴细胞下降也可能是唑来膦酸影响了破骨细胞的功能及影响造血干细胞的结果。Kalyan等人曾经提出,双磷酸盐导致的下颂骨坏死是因为γδT细胞细胞明显下降引起免疫长期效应改变的结果。以上实验结果都提示骨代谢与免疫系统之间紧密的联系,哩来膦酸治疗骨质疏松症可能是通过影响免疫系统来发挥抑制骨吸收的作用。目的通过通过观察原发性骨质疏松症患者第1次、第2次静脉滴注唑来膦酸后短时间(1～3天),及唑来膦酸作用长时间后(1年)外周血细胞计数、淋巴细胞亚群及骨代谢标志物的变化,探讨淋巴细胞免疫系统在唑来膦酸抗骨质疏松过程中的变化及意义。方法1.研究对象:选取自2015年1月起至2016年11月就诊于济南市中心医院疼痛科的原发性骨质疏松症住院患者30例。患者纳入标准为:确诊为原发性骨质疏松症患者;此前未应用双磷酸盐药物治疗;肝功能、血清钙离子、磷离子水平在正常范围;肌酐清除率>35ml/min。排除标准:患有血液系统疾病、免疫系统疾病、肿瘤、严重感染、用药前发热的患者。唑来膦酸(密固达,5mg,诺华公司)给药方法严格按照说明书进行,每年静脉滴注给药1次(至少30分钟以上),共用2次,治疗期间所有患者同时使用钙剂(600mg/天)和骨化三醇(0.5μg/天)作为基础补充。2.观察指标:2.1于首次应用唑来膦酸前、用药1年后,观察下列指标:应用定量CT(QCT)检测腰椎骨密度;应用电化学发光法检测外周血骨代谢标志物:骨钙素(N-MID)、甲状旁腺激素(PTH)、25(OH)D、Ⅰ型胶原羧基端β特殊序列(β-CTx)水平。应用全自动五分类血液分析仪检测血细胞分析,应用全自动生化分析仪检测血离子水平,应用流式细胞技术检测外周血淋巴细胞亚群(CD3+细胞、CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+ 比值、CD 16+CD56+细胞、CD19+细胞)。2.2于首次及第2次应用唑来膦酸前及用药后第1天、2天、3天,观察下列指标:应用全自动五分类血液分析仪检测血细胞分析,应用全自动生化分析仪检测血离子水平,应用流式细胞技术检测外周血淋巴细胞亚群(CD3+细胞、CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+细胞、CD19+细胞)。结果首次应用唑来膦酸治疗,30例原发性骨质疏松症患者入组,男性9例,女性21例,平均年龄为(73.28±6.44)岁;第2次应用唑来瞵酸时,退出4例,剩余26例患者完成研究,男性7例,女性19例,平均年龄为(75.21±5.01)岁。1.首次应用唑来膦酸1年后与用药前相比,患者腰椎骨密度T值由(-3.78±0.76)提高到(-2.83±0.65),差异具有统计学意义(P<0.05);外周血骨代谢标志物N-MID、PTH、25(OH)D变化无统计学意义(P>0.05),而β-CTx明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。血细胞分析、血离子水平、淋巴细胞亚群差异无统计学意义(P>0.05)。2.1与用药前相比,首次应用唑来膦酸后第1天,外周血白细胞总数(WBC)、中性粒细胞计数(NEU)、中性粒细胞百分比(NEU%)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),淋巴细胞计数(LYM)、淋巴细胞百分比(LYM%)、嗜酸性细胞计数(EOS)、嗜酸性细胞百分比(EOS%)下降,差异具有统计学意义(P<0.01),嗜碱性细胞(BAS)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)及血小板计数(PLT)改变均无统计学意义(P>0.05)。外周血离子钠离子(Na)、钙离子(Ca)、磷离子(P)明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);钾离子、氯离子水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。淋巴细胞亚群变化结果,CD3+细胞(T淋巴细胞)、CD3+CD4+细胞(辅助T细胞)、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+细胞(NK细胞),明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01);CD3+CD8+细胞(细胞毒性T细胞)、CD19+细胞(B淋巴细胞),细胞计数降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.2.与用药前相比,首次应用唑来膦酸后第2天,外周血细胞NEU%明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),LYM、LYM%、EOS、EOS%仍明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),其余细胞改变无统计学意义。外周血离子Na、K、Ca、P明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);C1水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。淋巴细胞亚群变化结果,CD3+细胞、CD3+CD4+细胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+细胞明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01);CD3+CD8+细胞、CD19+细胞,细胞计数降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.3与用药前相比,首次应用唑来膦酸后第3天,外周血WBC明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),LYM计数仍明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),其余细胞改变无统计学意义。外周血离子Ca、P水平仍明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);Na、K离子差异无统计学意义(P>0.05)。淋巴细胞亚群变化结果,CD3+细胞、CD3+CD4+细胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值仍降低,但差异无统计学意义(P>0.05),CD16+CD56+细胞,明显下降,差异仍具有统计学意义(P<0.05);CD3+CD8+细胞、CD19+细胞计数降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.1第2次应用唑来膦酸后第1天,与此次用药前相比,外周血细胞NEU%明显增高,差异具有统计学意义CP<0.01),其它细胞差异无统计学意义(P>0.05);血离子水平及淋巴细胞亚群变化均无统计学意义(P>0.05)。3.2第2次应用唑来膦酸后第2天,与此次用药前相比,外周血细胞WBC、NEU、NEU%上调,差异具有统计学意义(P<0.01),LYM%、EOS%下调,差异具有统计学意义(P<0.01)。血离子Ca、P差异无统计学意义。淋巴细胞亚群中CD3+CD4+细胞计数明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),其余分类差别无统计学意义。3.3第2次应用唑来磷酸后第3天,与此次用药前相比,血细胞分析、血离子水平、淋巴细胞亚群结果,变化均无统计学意义(P>0.05)。结论1.原发性骨质疏松症患者首次应用唑来膦酸后3d内,外周血中性粒细胞计数及比例先上升后下降,淋巴细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞比例下降;血清钙离子、磷离子水平下降;CD3+细胞计数、CD3+CD4+细胞计数、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+细胞计数均明显下降,证实唑来膦酸短时间内下调原发性骨质疏松患者外周血T细胞、CD4+T细胞及NK细胞计数,同时下调嗜酸性细胞,对淋巴免疫系统产生影响。2.原发性骨质疏松症患者第2次应用唑来膦酸后3d内,外周中性粒细胞计数及百分比增高、淋巴细胞计数及百分比降低幅度明显降低,淋巴细胞亚群中CD3+CD4+细胞在第2d时降低,降低幅度明显低于首次用药后变化。这与第二次用药急性期反应发生率、反应程度明显降低相符,不仅证实了急性期反应与唑来膦酸影响外周血淋巴细胞有关,更证实了唑来膦酸对淋巴细胞免疫系统的直接影响作用。3.原发性骨质疏松症患者应用唑来膦酸1年后,骨吸收活性下降,骨密度增加,骨质疏松症患者外周血细胞分析、淋巴细胞亚群计数及比例等较1年前未用药时并无显著差异,证明唑来膦酸对淋巴细胞免疫系统的影响作用是可控的。唑来膦酸可能是通过影响淋巴细胞、免疫系统,而作用于骨代谢及骨骼系统,从而发挥抑制骨吸收的作用,改善骨质量,这为唑来膦酸治疗骨质疏松的免疫机制开拓了新思路。