论文部分内容阅读
鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)在鸭群中传播迅速,造成病鸭的死亡率在5%-30%之间。该病的发生和流行给我国的养鸭产业带来了巨大的经济损失。HMGB1(high mobility group box protein 1,HMGB1)是一种非组蛋白染色质相关的核蛋白,在细胞核内具有识别、结合及改变DNA内部结构的能力,最后参与了DNA的转录、复制和修复等过程。HMGB1可以通过促进树突状细胞表达CD40和CD80等细胞标记物,促使DC细胞的成熟和迁移,也在获得性免疫中扮演着重要角色。本研究探索CRISPR/Cas9慢病毒系统在DEF细胞内HMGB1基因的编辑,探索该病毒与宿主先天性免疫的互作机制。本实验最先使用CRISPR/Cas9方法敲低鸭胚成纤维(Duck embryo fibroblast,DEF)细胞中的鸭HMGB1(Duck HMGB1,duHMGB1)并感染DTMUV,第一次在原胚细胞的基础上对CRISPR/Cas9系统的活性及HMGB1基因介导DTMUV感染的免疫应答机制进行了验证。以duHMGB1为靶向基因,在DEF细胞敲低duHMGB1基因,并委托吉凯基因公司合成CAS9-定制-慢病毒(单载体)名称分别为LV-HMGB1-sgRNA、LV-HMGB1-sgRNA、LV-HMGB1-sgRNA以及阴性对照病毒。并合成三对CRISPR/Cas9活性检测引物。以感染了上述3种慢病毒及阴性对照病毒的DEF细胞为模板,提取细胞RNA后,反转录为cDNA。根据上述特异性扩增引物,进行PCR扩增反应。将目的条带进行胶回收后,用错配酶酶切各自的目的条带,然后用2%琼脂糖凝胶电泳对得到的产物进行验证,建立了以CRISPR/Cas9系统介导DEF细胞基因稳定敲低的方法。以DEF细胞为模型,检测在感染DTMUV后,病毒在细胞中的复制情况,并通过荧光定量PCR检测感染DTMUV的DEF细胞(敲低duHMGB1)中IFN-Ⅰ(IFN-α,IFN-β)和ISGs(PKR,Mx,OAS)mRNA表达量的变化。用DTMUV感染DEF细胞后,IFN-Ⅰ和ISGs的表达量下调显著,IFN-α的表达量下调了12.4倍(P<0.001),IFN-β的表达量下调了8.1倍(P<0.01),PKR的表达量下调了14.2倍(P<0.001),Mx的表达量下调了7.6倍(P<0.01),OAS的表达量下调了7.2倍(P<0.01)。结果表明,duHMGB1在DTMUV感染过程中能够调节IFN-α、IFN-β、PKR、Mx和OAS的表达。本研究成功建立了CRISPR/Cas9介导的敲低DEF细胞HMGB1基因方法,通过DTMUV体外感染,验证duHMGB1参与的信号通路过程,明确了duHMGB1在宿主抗DTMUV感染先天性免疫中的作用。研究结果为研发抗DTMUV感染的新型药物及疫苗佐剂奠定了理论基础。