丹皮酚对局灶性脑缺血的保护作用及对pAkt、Nrf2和HO-1调节作用的实验研究

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目的:脑血管病是我国居民死亡和致残的首位原因,以缺血性脑血管病最为常见。脑缺血后继发损伤是一个复杂的病理级联反应,发病机制包括炎症反应、氧化应激、Ca2+稳态失调、细胞毒性作用等。氧化应激广泛存在于脑梗死后坏死和缺血区域,是导致继发性脑损伤的主要因素。已有研究表明,大量氧自由基的产生会引起氧化应激加剧脂质,DNA等大分子物质的损伤。脑作为人体耗氧量最大的器官,含有大量脂质,对氧化应激损伤最为敏感。如何减轻氧化应激损伤已逐渐成为临床治疗缺血性脑血管病的的热点与重点。磷酸化的Akt可以有效影响脑梗死的病理进展。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt又名蛋白激酶B(Protein Kinase B, PKB)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员,在一系列细胞凋亡、能量代谢、基因表达等过程中通过调节基础转录基因发挥重要作用。Akt可以使转录因子E2相关因子2激活,在脑缺血后机体抗氧化应激反应中发挥重要作用。转录因子E2相关因子2(NF-E2related factor2,Nrf2)是细胞发生氧化应激反应中的关键因子及中枢调节者,通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相互作用,在自身防御机制中起着非常重要的作用。Nrf2通过诱导一系列抗氧化剂保护蛋白编码,促进细胞内氧化还原反应环境的条件调节,是细胞内抗氧化应激的重要通路。Nrf2/ARE信号通路可诱导多种化学保护Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶,提高谷胱甘肽、谷胱甘肽S-转移酶及超氧化物歧化酶等抗氧化物质的表达。其中HO-1是重要的Ⅱ相解毒酶,是普遍存在的应激蛋白,可以通过催化血红素代谢为CO、铁、胆绿素等发挥其强大的抗氧化能力。现HO-1已成为反映细胞内抗氧化能力的重要指标。综上所述,Nrf2信号的激活可以有效清除自由基等氧化物质,维持细胞内的氧化还原水平,发挥其重要的细胞保护作用。丹皮酚(Paeonol,PN)是从毛莨科植物牡丹根皮与萝摩科植物徐长卿干燥根或全草中提取的主要有效成分,是天然的抗氧化剂,其药理活性十分广泛。大量实验研究表明丹皮酚通过发挥其抗炎、抗氧化作用在治疗阿尔兹海默病、糖尿病、肿瘤等方面具有重要作用。除此之外,丹皮酚可以减少氧自由基,减轻氧化应激改善D-半乳糖诱导的认知障碍。现通过经典pMCAO模型探究丹皮酚是否具有脑保护作用,以及其作用机制与phospho-Akt、Nrf2、HO-1、Claudin-5以及超氧化物岐化酶的活性是否相关。方法:实验分为两部分:实验一,丹皮酚的脑保护作用研究。实验二,丹皮酚治疗组的phospho-Akt、Nrf2、HO-1的含量变化。实验一:采用成年健康雄性CD-1(ICR)小鼠,随机分为假手术组(Sham)、单梗组(pMCAO)、溶剂对照组(Vehicle)、丹皮酚小剂量(30mg/kg)组(PN-L)及丹皮酚大剂量(60mg/kg)组(PN-H)。制作小鼠右侧大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery was occluded,MCAO)。术前三天连续灌胃给药,大脑中动脉阻塞术前30分钟再次灌胃给予丹皮酚溶液(30mg/kg或60mg/kg),并于术后24小时进行神经功能评分,完毕后动物断头处死,留取病变侧脑组织采用干湿重法对脑含水量进行测定,采用2%2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazoliumchloride, TTC)染色测定脑梗死体积。实验二:采用成年健康雄性CD-1(ICR)小鼠,随机分为假手术组(Sham)、单梗组(pMCAO)、溶剂对照组(Vehicle)、丹皮酚小剂量(30mg/kg)组(PN-L)及丹皮酚大剂量(60mg/kg)组(PN-H)。干预组采取灌胃给药。采用蛋白印迹法(Western Blot)测定pAkt、Nrf2、HO-1以及Claudin-5的蛋白水平,实时定量聚合酶链反应(qR-T PCR)测定Nrf2、HO-1以及Claudin-5的mRNA表达情况。应用试剂盒检测小鼠大脑皮层梗塞灶中超氧化物岐化酶(SOD)的活性变化。结果:1.采用6分法评价小鼠神经功能行为学。评分于MCAO术后24h进行。PN-H组与Vehicle组相比,神经功能缺损显著改善(P <0.05)。PN-L组虽较Vehicle组可降低评分,但差异不具有统计学意义。2.比较手术同侧脑含水量。假手术组为79.08±0.78%,pMCAO组与Vehicle组相比,含水量相近差异不具有统计学意义。Vehicle组为84.61%±0.61%,与其相比,丹皮酚治疗组脑组织含水量降低并具有统计学差异(Vehicle vs. PN-L:84.61%±0.61%vs.82.16±1.02%;Vehicle vs. PN-H:84.61%±0.61%vs.81.68±1.23%)(P <0.05)。比较手术对侧脑含水量,5组基本相近,差异无统计学意义(P>0.05)。3.假手术组大脑皮层未见梗死灶。与溶剂对照组相比,PN大剂量组梗死体积明显减小(P <0.05),PN小剂量组虽可减小梗死体积,但与溶剂对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.丹皮酚对phospho-Akt、Nrf2、HO-1表达的影响:与Vehicle组相比,PN-L和PN-H两组中的phospho-Akt、HO-1在蛋白水平的表达明显增多(P <0.05),PN-H组Nrf2在细胞核内积累增多(P <0.05),同样,在PCR的检测中发现,丹皮酚大剂量组较溶剂对照组相比Nrf2,HO-1mRNA表达水平也明显升高(P <0.05)。5.丹皮酚对Claudin-5表达的影响:与溶剂对照组相比,PN高剂量与低剂量组上调Claudin-5在蛋白水平表达,高剂量组亦可使Claudin-5mRNA表达增多。差异均具有统计学意义(P <0.05)。6.丹皮酚对SOD的影响:相比于Sham组,小鼠脑缺血后梗塞灶皮层中超氧化物岐化酶(SOD)的活性反射性升高(P <0.05)。丹皮酚干预后,SOD活性进一步升高,与Sham组、Vehicle组比较差异均具有统计学意义(P <0.05)。结论:给予丹皮酚进行早期脑梗死干预后,明显降低脑水肿程度,减少梗死体积,改善神经功能行为学评分;进一步的研究表明丹皮酚可上调了phospho-Akt、Nrf2、HO-1和Claudin-5的表达水平,增加SOD的活性,改善血脑屏障的通透性。对脑缺血后脑组织具有保护作用,其机制可能与激活Akt/Nrf2/HO-1通路有关,为丹皮酚临床应用提供了理论基础。结论:脑梗死后早期给予丹皮酚干预,脑含水量明显降低,梗死体积减少,神经功能行为缺损评分改善;丹皮酚可上调了phospho-Akt、Nrf2、HO-1和claudin-5的表达水平,增加SOD的活性,对脑缺血后脑组织具有保护作用,为丹皮酚临床应用提供了理论基础。
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