论文部分内容阅读
目的:本论文旨在提取和纯化新疆两色金鸡菊总黄酮,同时建立纯化总黄酮有效部位的UPLC化学成分分析与含量测定方法;另外,考察总黄酮中化学成分的清除自由基、抗氧化以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力,为两色金鸡菊新药研发,以及其体内药物代谢动力学的研究提供基础依据。方法:(1)采用响应面分析(Response Surface Analysis Methodology,RSM)法超声波提取总黄酮,Box-Behnken中心组合设计模型优化,确定超声波提取参数,通过XDA-1、NKA-10、AB-8等10余种大孔吸附树脂对提取总黄酮的吸附和解吸性能的考察,筛选出具有较强的吸附性能和较好的解吸能力的大孔树脂,纯化与富集总黄酮有效部位。(2)采用UPLC-PDA对大孔吸附树脂纯化后总黄酮进行定性分析,采用ACQUITY UPLC?HSS T3(1.8μm,2.1×100 mm),以乙腈-0.5%甲酸水为流动相,流速0.2 ml·min-1,进样体积1μl,温度30o C,检测波长280 nm,确定总黄酮含有的化学成分,建立各化学成分纯化前后的含量测定方法,分别获得各化学成分含量。(3)采用薄层色谱-生物自显影(Thin Layer Chromatography Bioautography,TLC-Bio)技术跟踪检识新疆两色金鸡菊纯化总黄酮中具有抗氧化、α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的活性有效成分,建立总黄酮体外清除自由基,抗脂质过氧化和α-糖苷酶活性抑制的实验方法。结果:(1)经过对超声时间、液料比、乙醇浓度这三个条件优化后,确定为液料比21:1、提取时间30 min、乙醇浓度60%,获得质量较稳定、含量较高的总黄酮提取物,提取率平均可达4.65%;筛选出AB-8型大孔吸附树脂对新疆两色金鸡菊总黄酮进行纯化富集:总黄酮上样浓度为0.54 mg·ml-1,上样量为树脂体积的2.1 BV,吸附平衡4 h,2~3 BV蒸馏水冲洗柱床,2.2 BV的50%乙醇洗脱,分段收集,可获得较高含量的总黄酮有效部位。(2)在新疆两色金鸡菊纯化总黄酮定性分析中,确定纯化后总黄酮含有以下种物质:矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、绿原酸、黄诺马苷、栎草亭-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、黄酮奥卡宁、马里苷、奥卡宁、木犀草素、槲皮素,分别测定含量,其线性范围分别10.04-100.4μg·ml-1、2.51-40.16μg·ml-1、49.80-298.80μg·ml-1、49.80-298.80μg·ml-1、2.51-40.16μg·ml-1、50.00-300.00μg·ml-1、64.00-384.00μg·ml-1、50.20-301.20μg·ml-1、2.48-39.68μg·ml-1、2.50-40.00μg·ml-1在浓度范围内线性关系良好(r值均>0.999),加样回收率均在98%-100%。(3)在TLC-Bio方法筛选总黄酮生物活性成分的实验中,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8:7.4:3)为展开剂,分别以DPPH与ABTS甲醇溶液进行显色,检识分析大孔吸附树脂纯化后总黄酮中具有抗氧化作用成分;以相同薄层色谱条件展开纯化总黄酮,以α-葡萄糖苷酶为酶源,以对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p NPG)为底物,以固蓝B盐为显色剂,日光下检识到具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的化学成分;纯化后总黄酮体外清除DPPH、ABTS与抗脂质过氧化的能力(IC50)依次是,(58.75±2.549)、(23.13±0.0004)与(19.74±1.09)μg·ml-1;采用p NPG法测定α-葡萄糖苷酶与大鼠小肠α-糖苷酶群的抑制活性,其IC50分别为(46.79±9.024)与(0.771±7.735)mg·ml-1。结论:(1)响应面分析法优化超声波提取总黄酮工艺参数,可获得较高含量的总黄酮提取物;AB-8型大孔吸附树脂对两色金鸡菊总黄酮有效部位具有较好的纯化富集作用。(2)总黄酮中含有的马里苷、黄诺马苷、奥卡宁、黄酮奥卡宁具有较好自由基清除能力与α-葡萄糖苷酶活性抑制能力;(3)纯化后总黄酮对DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基与脂质过氧化均有具有较强的抗氧化活性,可作为一种新的自由基清除剂和天然抗氧化剂;纯化后总黄酮具有作为新型α-葡萄糖苷酶抑制剂与抗氧化剂的药用开发价值。