论文部分内容阅读
大肠杆菌乳糖操纵子阻遏蛋白／操纵子系统已经成为理解蛋白质和核酸相互作用及基因表达调控的模型。Ptac启动子是研究基因表达最常用的启动子之一，在Ptac启动子基础上建立的表达系统受lacI基因编码的阻遏蛋白调控。阻遏蛋白不能完全阻遏外源基因的表达，会产生本底水平泄漏。而外源基因编码的毒性蛋白泄漏表达对宿主生长是有害的甚至是致死的，因此必须严紧控制外源基因表达。本研究通过DNA改组技术对野生型lacI基因进行突变重组，即经过野生型lacI基因PCR扩增，DNaseⅠ降解，Primerless PCR，Primer PCR；得到大量的突变lacI基因，从中筛选得到超级阻遏蛋白突变基因。 在pYPX4062质粒(GenBank No，AY178451)的基础上构建原核表达载体pYF6683，pYPX4062质粒是带有双抗性(氨苄青霉素和卡那霉素抗性)的原核广宿主载体(Broad-host-range vector)，该质粒带有两个原核表达单元。载体上的一个基因表达单元是由原核P_L强启动子控制的lacZ基因表达单元，另一个是由原核庆大霉素抗性基因启动子(GmP)控制的庆大霉素抗性基因(Gm~r)表达单元，以上两个表达单元的终止子都是λ噬菌体的T1T2终止子。在pYF6683质粒上，由带laeI结合位点的tac启动子替换了pYPX4062表达载体中的P_L启动子，同时lacI基因替代了pYPX4062表达载体中的Gm~r基因。将得到的突变lacI基因和原核表达载体pYF6683用限制性内切酶BamHI和SacI酶切，回收载体和片段，进行连接反应，连接物电击转化构建原核表达质粒库，库容量5～8×10~6个转化子。根据转化子lacZ基因表达活性，用X-gal作为筛选显色剂，通过两轮蓝白筛选，获得了四个乳糖操纵子超级阻遏蛋白突变基因。在没有诱导物IPTG时，超级阻遏蛋白能够完全阻遏重组转化子中lacZ基因的表达，而存在诱导物IPTG时，重组转化子中lacZ基因能够大量表达。 测序和序列分析表明，和野生型lacI基因比较，四个突变lacI基因2W7、3W1、5W12和5W16发生了碱基改变，同时引起相应氨基酸的变化。氨基酸突变位点A43V位于阻遏蛋白氨基末端，是阻遏蛋白和操纵基因的结合区；S93L、S102N、G315S、Q180R、M249I、I283T均位于阻遏蛋白核心区，即阻遏蛋白和IPTG结合区。与已经报道lacI突变子的氨基酸突变位点比较表明：2W7(A43V)和3W1(S93L)是新发现的IPTG诱导型超级阻遏蛋白突变子；5W12(S102N，浙江大学硕士学位论文03 1 55)和5w16(Q18oR，M2491，xZs3T)则发生T两个以上氨基酸位点改变。值得注意的是，这几个突变氨基酸位点都处在四聚体阻遏蛋白晶体结构表面，推测氨基酸的改变可能引起了阻遏蛋白构象变化，从而产生完全阻遏现象。