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第一部分组蛋白乙酰化转移酶GCN5失活上调Bim表达诱导神经元凋亡 目的： 探讨组蛋白乙酰转移酶GCN5在神经元中的作用及机制。 方法： 1.分别用组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase,HAT）GCN5抑制剂CPTH2和MB3，p300抑制剂C646，Tip60抑制剂MG149，浓度和时间依赖地处理小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons， CGNs)， Western blot分析H3K9/H3K27/H4K12乙酰化水平及凋亡标记蛋白 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，Hoechst核染色检测核固缩形态、DNA ladder检测DNA切割片段。 2.验证GCN5活性下调对神经元凋亡的影响。用小分子干扰沉默GCN5，检测神经元凋亡率。 3.用抑制剂CPTH2、MB3处理神经元或小分子干扰沉默GCN5，Western blot、免疫荧光检测促凋亡蛋白Bim表达。 4.验证Bim活性对神经元凋亡的影响。CPTH2抑制GCN5或小分子干扰沉默GCN5条件下，小分子干扰沉默Bim，检测神经元凋亡。 5.腺病毒过表达GCN5，检测Caspase-3、Bim表达及神经元凋亡。 6.验证组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）拮抗 GCN5活性下调诱导的神经元凋亡。CPTH2抑制GCN5条件下，应用组蛋白去乙酰化酶（TSA、SAHA、M344、VPA、MS275）处理神经元，检测Bim表达及神经元凋亡。 结果： 1.乙酰化转移酶GCN5抑制剂CPTH2、MB3诱导小脑颗粒神经元凋亡。 CPTH2、MB3抑制GCN5，减少H3K9乙酰化水平，神经元出现明显核固缩，且DNA ladder检测到切割的DNA片段，而C646抑制p300，减少H3K27乙酰化水平、MG149抑制Tip60减少H4K12乙酰化水平，都没有出现明显的核固缩，也没有出现明显的DNA切割片段。而且，CPTH2、MB3激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7。统计结果表明，与对照相比，CPTH2、MB3处理显著增加神经元凋亡率，差异有统计学意义（P<0.05），而C646、MG149处理后神经元凋亡率与对照比较差异没有统计学意义（P>0.05）。 2.沉默GCN5表达诱导小脑颗粒神经元凋亡。 结果显示，与对照相比，小分子干扰沉默GCN5，神经元凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。 3.GCN5活性下调，增加促凋亡蛋白Bim表达，诱导神经元凋亡。 CPTH2、MB3浓度及时间依赖地转录水平上调Bim表达，小分子干扰沉默GCN5后，Bim表达明显增多。统计表明，与对照NC比较，干扰GCN5显著增加神经元凋亡率，差异有统计学意义（P<0.05）。 4.GCN5活性下调诱导的神经元凋亡依赖Bim表达。 CPTH2抑制GCN5条件下，小分子干扰沉默Bim，神经元凋亡率下降，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步沉默GCN5条件下，小分子干扰沉默Bim，神经元凋亡率下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 5.过表达GCN5，抑制Bim表达及凋亡。 腺病毒过表达GCN5，转录水平抑制Bim表达，Caspase-3表达也下调，神经元核固缩减少，神经元凋亡率明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 6.HDACIs拮抗GCN5失活诱导的Bim表达及神经元凋亡 TSA呈浓度依赖地减少CPTH2诱导的Bim表达，并且SAHA、M344、VPA也能有效地减少CPTH2诱导的Bim的表达。进一步发现HDAC ClassI类家族的抑制剂MS275也呈浓度依赖地减少CPTH2诱导的Bim表达。并且上述HDACIs均有效地降低CPTH2诱导的神经元凋亡率（P<0.05）。 结论: 1.GCN5活性下调诱导神经元凋亡。 2.抑制GCN5通过转录上调Bim诱导神经元凋亡。 3.HDACIs拮抗GCN5活性下调诱导的Bim表达及神经元凋亡 第二部分组蛋白去乙酰化酶HDAC6调控MKK7表达及神经元凋亡机制研究 目的： 探讨组蛋白去乙酰化酶调控MKK7表达及神经元凋亡的机制研究。 方法： 1.验证多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）（TSA，SAHA，M344，VPA）对神经元的作用。上述抑制剂分别处理存活状态（25K）和凋亡刺激（5K或秋水仙碱）条件下的神经元，hoechst核染色计数细胞凋亡率，Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7表达； 2.在5K或者秋水仙碱条件下，Western blot检测JNK/c-Jun活性变化，以及HDACIs抑制剂（TSA，SAHA，M344，VPA）对JNK/c-Jun活性影响。 3.验证是MKK7还是MKK4介导JNK/c-Jun激活，小分子干扰沉默MKK7和MKK4，免疫荧光检测p-c-Jun表达。 4.探讨HDACIs是否抑制MKK7。应用TSA浓度梯度及时间梯度处理5K条件下神经元，检测 MKK7表达及 mRNA水平。进一步使用多种抑制剂 TSA， SAHA，M344，VPA分别处理5K秋水仙碱条件下的神经元，检测MKK7蛋白及 mRNA水平。 5.探讨哪个HDAC成员参与调控MKK7表达及神经元凋亡。使用特异性抑制HDAC class I类（HDAC1， HDAC2，HDAC3，HDAC8）成员的抑制剂MS275处理5K条件下神经元，检测MKK7表达情况。接着使用特异性针对HDAC6的3种抑制剂（Tubacin，Cay10603，Tubasatin A）处理5K或秋水仙碱条件下神经元，检测 MKK7/JNK/c-Jun通路表达情况。最后用 HDAC6抑制剂 Tubacin或Cay10603分别处理5k或秋水仙碱条件下神经元，检测神经元凋亡率。 6.检测组成性激活MKK7/JNK通路能否拮抗HDACIs的抗凋亡效应。转染pCDNA3.1-MKK7-JNK1激活型质粒和 pCDNA3.1-MKK7-JNK1-APF失活型质粒，在5K或秋水仙碱条件下分别加入Tubacin、SAHA后，计数神经元凋亡率。 结果： 1.25K存活条件下，加入四种HDACIs（TSA，SAHA，M344，VPA），并没有明显改变神经元的凋亡率，也没有激活Caspase-3表达；而在5K或秋水仙碱条件下，上述四种HDACIs都能明显降低神经元凋亡，抑制Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7激活。 2.在5K或秋水仙碱条件下JNK/c-Jun通路激活，加入四种HDACIs（TSA， SAHA，M344，VPA）能有效地抑制JNK/c-Jun通路活性。 3.免疫荧光显示，沉默MKK7表达，p-c-Jun水平下降，而沉默MKK4表达并不影响p-c-Jun水平。 4.Western blot显示，TSA呈浓度依赖和时间依赖地下调MKK7表达；同时， TSA、SAHA、M344、VPA在5K或者秋水仙碱条件下都抑制MKK7蛋白表达及mRNA水平。 5.HDAC class I类抑制剂MS275不能抑制MKK7表达，而HDAC6抑制剂（Tubacin，Cay10603，Tubasatin A）均抑制 MKK7表达进而抑制 JNK/c-Jun活性。同时，HDAC6抑制剂Tubacin、Cay10603抑制5K或秋水仙碱诱导的神经元凋亡 6.过表达组成性激活MKK7，使神经元凋亡率增加，而且拮抗Tubacin、SAHA的抗凋亡效应，而转染组成性失活型MKK7无此效应。 结论： 1.HDACIs在存活条件下没有显著诱导神经元凋亡，但抑制5K或秋水仙碱诱导的神经元凋亡； 2.HDACIs抑制凋亡通过转录抑制MKK7及下调JNK/c-Jun活性。 3.MKK7表达依赖HDAC6活性，抑制HDAC6抑制MKK7介导的神经元凋亡。