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第一部分纤维环和髓核细胞原代培养及鉴定目的：探讨兔纤维环和髓核细胞的分离、体外培养方法，并对细胞表型进行鉴定。方法：采用酶消化法分离兔纤维环和髓核组织，进行单层培养，倒置相差显微镜观察细胞生长和形态学变化，甲苯胺蓝染色检测纤维环和髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达，免疫细胞化学法对纤维环细胞行I、II型胶原以及碱性磷酸酶染色，对髓核细胞行Ⅱ型胶原染色。结果：采用0.25%胰蛋白酶加粗品胶原酶可较好的分离培养出兔纤维环和髓核细胞。原代纤维环细胞多呈梭形或三角形，甲苯胺蓝染色呈阳性，I、II型胶原以及碱性磷酸酶染色均可见阳性表达；原代髓核细胞呈类圆形、短梭形或三角形，甲苯胺蓝染色呈阳性，II型胶原染色可见阳性表达。结论：采用0.25%胰蛋白酶加粗品胶原酶消化法体外成功培养出兔纤维环和髓核细胞；纤维环细胞和髓核细胞呈类软骨表型，纤维环细胞合成分泌聚集蛋白聚糖和I、II型胶原，髓核细胞合成分泌聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白。第二部分髓核和纤维环细胞凋亡途径的实验研究目的：明确椎间盘纤维环细胞和髓核细胞的凋亡途径。方法：取原代培养的纤维环细胞和髓核细胞，分别建立2个实验组：原代细胞+10%血清培养基，原代细胞+0%血清培养基。分别共培养48小时后采用流式细胞仪测定纤维环和髓核细胞的凋亡率，并分别以试剂盒和Western blot法测定细胞凋亡过程中产生的caspase3、8、9以及细胞色素C和Bid蛋白量的变化。结果：与10%血清培养的细胞相比，0%血清培养48小时的纤维环细胞和髓核细胞均经历了明显的凋亡（P＜0.01）。纤维环细胞凋亡过程中caspase3、8酶的量显著增加（P＜0.01），而caspase9、细胞色素C和Bid蛋白的量变化不明显；而髓核细胞凋亡的过程中，caspase3、9酶以及细胞色素C和Bid蛋白的量显著增加（P＜0.01），而caspase8酶的量变化不明显。结论：纤维环细胞和髓核细胞凋亡的途径不同，纤维环细胞是通过细胞表面死亡受体途径实现细胞凋亡的，而髓核细胞是通过线粒体途径实现细胞凋亡的。第三部分Q－VD－OPH对体外培养纤维环及髓核细胞凋亡的影响目的：研究广谱半胱天冬酶抑制剂Q－VD－OPH对体外培养的纤维环和髓核细胞凋亡的影响，并检测其对caspase3、8、9酶活性的影响，以明确其对椎间盘纤维环和髓核细胞凋亡的抑制作用。方法：取原代培养的纤维环细胞和髓核细胞，分别建立3个实验组：原代细胞+10%血清培养基，原代细胞+1%血清培养基，原代细胞+1%血清培养基+50μM Q-VD-OPH，分别培养24、48、72h以后以流式细胞仪测定纤维环和髓核细胞的凋亡率，以Western blot检测BCL-2/BAX比值，并以试剂盒检测caspase3、8、9酶的活性。结果：与10%血清培养的纤维环细胞和髓核细胞相比，1%血清培养的细胞均经历了明显的凋亡（P<0.01）。但在各个时间点，加入Q-VD-OPH的细胞凋亡率均明显降低，与1%血清培养的细胞有非常显著性差别（P<0.01）。加入Q-VD-OPH后，纤维环细胞中的caspase3、8酶和髓核细胞中的caspase3、9酶的活力均明显降低，与1%血清培养的纤维环和髓核细胞相比有非常显著性差异（P<0.01）。结论：广谱半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH能降低纤维环细胞凋亡过程中产生的caspase3、8酶以及髓核细胞凋亡过程中产生的caspase3、9酶的活性，从而有效地预防纤维环细胞和髓核细胞的凋亡。第四部分Q－VD－OPH对兔体内椎间盘细胞凋亡的影响目的：采用18G穿刺针穿刺椎间盘，诱导兔椎间盘退变建立动物模型，并在造模同时注入广谱半胱天冬酶抑制剂Q－VD－OPH，以观察其对椎间盘退变的影响。方法：新西兰大白兔32只，用18G穿刺针穿刺L3/4、 L4/5及L5/6椎间盘，以自制深度控制器控制穿刺深度为5mm。分别建立4个实验组：A组正常椎间盘；B组单纯行穿刺组；C组穿刺同时注入5ul生理盐水；D组穿刺同时注入5ul Q－VD－OPH。分别在术后2、4、6、8周将大白兔处死取材，以流式细胞仪测定椎间盘细胞凋亡率，并以caspase3试剂盒测定各组caspase3量的变化。结果：流式细胞仪结果提示，与正常椎间盘相比，穿刺组、穿刺+生理盐水组和穿刺+Q－VD－OPH组的椎间盘细胞均经历了明显的凋亡，但穿刺+Q－VD－OPH组在2、4、6、8周时椎间盘细胞凋亡率均较其余两组细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。与正常椎间盘相比，在各个时间点的穿刺组和穿刺+生理盐水组椎间盘caspase3活力均有非常显著性增加，而穿刺后加入Q－VD－OPH，在各个时间点，caspase3活力均明显下降，与穿刺组和穿刺+生理盐水组相比有非常显著性差异（P＜0.01）。尤其是在第2和4周时，椎间盘细胞caspase3活力与正常椎间盘相比已无显著性差异。结论：广谱半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH能明显抑制椎间盘细胞凋亡过程中产生的caspase3酶的活力，阻断了椎间盘细胞凋亡的途径，能明显抑制椎间盘细胞的凋亡，从而抑制椎间盘退变。