研究背景与目的循环micro RNA是一类从细胞分泌到内环境中的小的非编码RNA,在血液、尿液、胆汁、脑脊液、胰液等各种体液中保持相对稳定。循环micro RNA的来源具有组织特异性,信息含量丰富,是癌症等疾病的理想非侵入性生物标记物。传统的micro RNA检测方法如PCR需要预先逆转录为c DNA、且需严格的温度循环条件、假阳性率高,因此迫切需要建立一种针对循环micro RNA简便、高效的恒温检测方法。循环micro RNA在内环境的丰度较低,因此需要更加有效的信号放大策略,以实现低检测限。相比复杂的材料改变策略,基于DNA纳米材料的信号扩增方法具有显著的优势。DNA不仅是遗传信息载体,也是一种可用于级联信号放大的可编程生物材料。DNA纳米材料具有优良的自组装能力和精确的识别能力,在生理条件下具有更好的的生物相容性。本研究基于靶标自循环的催化发卡自组装技术(Catalytic hairpin assembly,CHA)与三维(Three dimensional,3D)DNA纳米网状结构,结合电化学传感技术,构建了一种双信号放大的电化学生物传感器,以实现循环micro RNA高灵敏高特异性检测。研究方法1、设计发卡序列及X形DNA(X-DNA)的三条序列,使用www.NUPACK.Com分析相应核酸序列结构。2、聚丙烯酰氨凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及蓝色葡聚糖溶液实验表征DNA纳米网状结构的形成。3、PAGE分析证实在液相中mi R-21启动CHA并结合3D DNA纳米网状结构的可行性。4、将以上探针在电化学平台上构建CHA结合3D DNA纳米网状结构的生物传感器,实现循环micro RNA的快速、高效检测。5、通过差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)证实传感器的可行性,电化学阻抗法(Electrochemical impedance spectroscopy,EIS)及循环伏安法(Cyclic voltammetry,CV)来表征传感器的制备,证明CHA技术和3D DNA纳米网状结构对靶标信号的两次放大效果。6、优化CHA结合3D DNA纳米网状结构电化学传感器的实验参数:(1)优化发卡H1、H2的浓度。(2)优化CHA过程的反应时间及温度。(3)优化DNA纳米网状结构的浓度及孵育时间。7、评估CHA结合3D DNA纳米网状结构电化学生物传感器检测靶标mi R-21的性能:(1)计算电化学生物传感器的线性范围、检测限。(2)评估电化学生物传感器的特异性、稳定性及重复性。(3)评价电化学生物传感器的实际应用效果。研究结果通过PAGE及蓝色葡聚糖溶液实验成功验证了3D DNA纳米网状结构的形成,随后分别在液相及电化学平台成功构建生物传感器,证实了两次信号放大策略的可行性。传感器的最优实验条件为:发卡H1、H2浓度2μM,CHA反应时间1.5 h,CHA反应温度37℃,DNA纳米网状结构浓度0.5μM,DNA纳米网状结构孵育时间1.5 h。传感器的线性范围为10 f M-1 n M,检测限3.6 f M,具有识别单碱基突变和其他干扰micro RNA的能力、良好的稳定性、重复性,有较好的实际应用潜能。结论本研究基于电化学传感技术,利用靶标辅助的催化发卡自组装技术结合3D DNA纳米网状结构,成功构建了双信号放大生物传感技术,实现了循环micro RNA的高效、灵敏检测。这种基于DNA纳米材料的级联信号扩增方法,拓宽了DNA纳米技术在生物传感器领域的应用。