重组腺病毒(recombinant adenovirus)广泛应用于肿瘤基因治疗和疫苗载体的研究。以人腺病毒制备的载体具有以下特点：①安全性好；②外源基因容量大；③可在悬浮细胞内获得较高的滴度；④腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，整合突变致癌可能性小，基因毒性低；⑤宿主范围广，可感染分裂期及非分裂期细胞；⑥免疫原性强；⑦可通过联合免疫策略增强免疫效果。正是由于具有以上这些优点，腺病毒载体被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。目前应用最多的腺病毒载体是人血清5型腺病毒（Ad5），它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗的临床研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。然而，重组5型腺病毒(rAd5)的一个主要问题是人体针对载体本身存在十分普遍的预存免疫。临床试验表明，人体内较高滴度的Ad5中和抗体水平会显著地降低载体的转导效率和转基因表达水平，并且可能引发机体的不良反应。最新的腺病毒流行病学研究显示：西方发达国家Ad5的血清阳性率约60-70％，而非洲的撒哈拉和东南亚等一些发展中国家和地区的阳性率甚至高达98％。目前，我国关于腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗和疫苗的相关研究已经很多，但仍缺乏Ad5及一些有潜在应用价值的稀有血清型腺病毒的流行病学调查数据。除了预存免疫问题，rAd5可以说是一种近乎完美的基因治疗和疫苗载体，因此研究Ad5预存免疫的机理，开发能避免预存免疫的重组腺病毒载体具有很强的科学意义和应用价值。本论文通过分析机体内Ad5中和抗体的主要中和抗原位点，结合腺病毒流行病学调查和序列分析，对Ad5进行基因工程改造：即以稀有血清型腺病毒的中和抗原位点基因替换rAd5来构建嵌合载体，希望获得一种易于包装、免疫原性强且能有效避免机体预存免疫的新型rAd5载体。论文首先通过在全国各地收集健康人群血清，应用国际标准化的病毒中和试验检测了超过1000份血清中Ad5的中和抗体滴度。结果表明，我国健康成人血清中72%为Ad5中和抗体阳性（滴度＞18），与欧美等发达国家的感染率接近。结果同时显示，我国南方地区的Ad5血清阳性率较其他地区略高。综合分析地域、年龄、型别和民族等因素发现，地域和气候差异是影响腺病毒在成人中感染的主要因素。儿童是疫苗应用的重要群体，为进一步分析潜在的腺病毒载体应用人群，我们又对东北地区的儿童血清中Ad2和Ad5中和抗体水平进行了分组研究。结果表明，儿童的Ad5感染率较成人略低，其中7-12个月儿童血清中的Ad2和Ad5中和抗体水平最低，是较适合的腺病毒载体疫苗应用的候选群体。由于病毒中和试验操作难度较大且价格昂贵，难以应用于更多的腺病毒血清型的流行病学研究。为了方便研究一些稀有血清型病毒在我国感染情况，我们通过分析人血清中腺病毒中和抗体的性质，原核表达了多种血清型腺病毒衣壳蛋白的功能结构域，建立了一种方便、快速的分型检测人血清中腺病毒中和抗体的血清学方法。对比病毒中和试验发现，我们建立的方法准确度较高，与中和试验的吻合度在80%以上。应用该方法检测东北地区儿童血清表明，Ad37和Ad43等国外稀有血清型在我国的感染率同样较低。该部分的研究说明，解决Ad5预存免疫问题对于Ad5载体在我国的进一步研究和应用具有十分重要的意义。随后，在蛋白水平上对腺病毒的免疫学性质进行了研究，目的是寻找腺病毒衣壳蛋白最主要的中和抗原表位，为Ad5嵌合表位的选择以及替换策略提供依据。我们首先利用原核表达的5型腺病毒六邻体超变区（HVRs）和纤维蛋白头节区（Knob）蛋白研究了腺病毒衣壳蛋白特异的体液免疫反应，证实了在高感染人群以及动物免疫后均会产生主要针对六邻体的中和抗体。由于腺病毒载体的构建难度较大，我们利用构建的HVRs嵌合蛋白预先在蛋白水平上评价了六邻体蛋白的中和抗原表位。结果表明，原核表达的HVRs嵌合蛋白可以体现其在病毒中的结构和部分功能。并且与结构分析不同，HVR5和HVR7具有部分六邻体蛋白的中和抗原表位，而HVR1-7则完全体现了六邻体的抗原特异性。该结果为接下来的腺病毒载体嵌合改造基因和策略的选择提供了依据。为了获得既易于包装又能逃避机体预存免疫的嵌合型rAd5载体，根据序列分析和以上实验结果，我们选择性的构建了来自三种稀有血清型（Ad37、Ad43、Ad26）的Loop1,2、HVRs和Loop4基因的共14个嵌合腺病毒骨架质粒。Loop4基因的选择是希望其能够提高替换了来源于同血清型病毒抗原基因的嵌合载体的包装能力。将构建成功的嵌合骨架质粒与表达绿色荧光蛋白（GFP）的穿梭质粒共同转染HEK293细胞，检测嵌合载体的包装能力。结果显示，Loop1和Loop2以及全长HVRs的替换难以包装或复制能力较低，而同时替换Loop4基因也未使载体的包装能力有所提升。而基于Ad26、Ad37和Ad43，仅替换HVR5和HVR7的嵌合骨架质粒与穿梭质粒重组成功并获得复制能力较强的嵌合型病毒。另外，我们发现替换Ad43HVR5,7的嵌合质粒的包装效率显著地增加。随后，我们对成功包装的嵌合载体进行了包装、复制等体外活性的评价。结果表明，成功包装嵌合病毒载体保持了rAd5较强的转基因表达能力和转基因的稳定性。最后，以表达HIV1-Gag的嵌合型rAd5载体免疫小鼠发现，HVR5,7嵌合腺病毒载体针对Gag基因的免疫原性较强，其中rAd5HVR43（5,7）-Gag的免疫背景和免疫原性均与rAd5-Gag相当。然后我们按照人体感染腺病毒的程度差异，建立了具有不同Ad5中和抗体水平的预存免疫小鼠模型。以嵌合病毒载体通过不同的免疫策略免疫空白和预存模型小鼠，证实HVR5,7嵌合型rAd5载体在小鼠体内可以有效逃避中低程度的预存免疫。而通过Prime-Boost策略，嵌合载体可以一定程度的避免高水平的预存免疫效应。另外，结果同时表明一定程度的同亚群其它血清型的预存免疫并不影响rAd5载体疫苗的免疫原性。本论文的研究表明：我国人群感染5型腺病毒的程度同样较高，Ad5的预存免疫问题极大的限制了其进一步的研究和应用。然而，由于腺病毒在机体内免疫性质的复杂性，仅仅以现有的信息对其进行嵌合改造仍不足以完全避免人体内普遍存在的高水平的预存免疫，而过于复杂的基因工程修饰又会造成腺病毒载体的难以包装。因此提示我们必须进一步深入地研究腺病毒特别是Ad5的免疫机制，才有可能构建出更为理想的基因治疗和疫苗载体。尽管如此，本论文的相关研究仍然对于腺病毒的流行病学、免疫学性质、腺病毒载体的包装和免疫原性具有一定意义，也为腺病毒载体在我国的进一步应用提供了一些依据。