Viperin是一种干扰素诱导蛋白因子,具有抗病毒作用。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)属于黄病毒科黄病毒属,主要引起蛋鸭产蛋量下降和雏鸭死亡。为揭示Viperin蛋白抗DTMUV的作用机制,本研究通过表达鸭源Viperin蛋白,构建稳定表达Viperin基因的细胞系,在细胞水平探究了Viperin对DTMUV复制增殖及出芽的作用。一、Viperin蛋白的原核表达及多克隆抗体制备论文首先基于Gen Bank中不同动物源Viperin基因,用软件MEGA6.05建立系统发育树。然后将鸭Viperin基因克隆到p GEX-6P-1载体,原核表达Viperin融合蛋白。将纯化的Viperin融合蛋白免疫家兔,制备抗鸭Viperin多克隆抗体,ELISA法检测其效价为1:8000。二、Viperin蛋白对鸭坦布苏病毒在BHK-21细胞出芽的抑制作用首先,构建重组真核表达质粒p EGFP-N1-Viperin,转染BHK-21细胞,Viperin蛋白可在BHK-21细胞中瞬时表达。然后,将p EGFP-N1-Viperin和p EGFP-N1分别转染BHK-21细胞,再用DTMUV感染细胞,培养36 h后,用RT-q PCR检测细胞沉淀和上清中病毒拷贝数。其次,BHK-21细胞过表达Viperin蛋白后感染DTMUV,培养36 h,收集细胞样品。用EGFP单克隆抗体捕获该样品中与Viperin蛋白结合的物质进行质谱分析。结果显示,其中有2种与DTMUV复制有关的蛋白DDX3X、DDX5,4种与囊泡类蛋白相关的蛋白VAMP-3、囊泡转运蛋白SEC22、囊泡转运蛋白GOT1B、VAPA。鸭坦布苏病毒在BHK-21细胞中出芽受到抑制。三、稳定表达Viperin基因的BHK-21细胞系的构建首先,构建重组真核表达载体p LOV-e GFP-Viperin,再与p SPAX2、p MD2.G共转染293T细胞制备慢病毒样颗粒,将含慢病毒样颗粒的293T细胞培养上清感染BHK-21细胞,通过嘌呤霉素加压筛选,稳定传代20代后进行核酸水平、蛋白水平的鉴定。PCR检测到Viperin蛋白的c DNA、DNA;荧光显微镜下有绿色荧光,Western blot检测到Viperin蛋白的表达,表明成功构建稳定表达Viperin基因的BHK-21细胞系。综上,本研究制备了Viperin蛋白及其多克隆抗体,构建了稳定表达Viperin基因的BHK-21细胞系,且证明Viperin蛋白能抑制DTMUV的出芽,为进一步探究Viperin蛋白抗DTMUV出芽机制提供了方向。