拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国青蟹的常见种,是华南地区主要的养殖蟹类。近些年水产养殖产业发展迅速,饲料原料日益紧张,水产动物饲料供需矛盾逐年增加。为缓解国际鱼油资源短缺,本研究以拟穴青蟹为研究对象,在室内循环水系统进行养殖实验,以观察不同比例豆油替代鱼油的饲料对拟穴青蟹生长、体成分、组织脂肪酸组成和脂质代谢相关酶活指标的影响,以及青蟹肝胰腺和肌肉组织中脂肪酸合成、转运和分解关键基因的表达水平差异。并以高不饱和脂肪酸合成关键基因Δ6脂肪酸去饱和酶（Δ6 Fatty acyl desaturase,Δ6 Fad）启动子为切入点,筛选并克隆调控Δ6 Fad基因的主要转录因子,在此基础上探讨豆油替代鱼油的饲料中脂肪酸对拟穴青蟹脂质代谢的调控机理。本研究有助于为拟穴青蟹人工配合饲料的研发提供数据参考,为甲壳动物脂质代谢提供理论资料。对于开发营养均衡、成本经济的青蟹饲料有重要意义。本文的研究内容和主要研究结果如下:1.饲料中豆油替代鱼油对拟穴青蟹生长性能及生化组成的影响以鱼粉、酪蛋白、复合维生素、复合矿物质等为基础饲料原料,并分别添加8%水平的不同比例鱼油和豆油混合的油脂,配制成6种等氮等脂（粗蛋白45%,粗脂肪9.5%）配合饲料饲喂青蟹（20.19±0.82 g）10周,豆油替代鱼油比例分别为0%（SO0）、20%（SO20）、40%（SO40）、60%（SO60）、80%（SO80）及100%（SO100）。实验青蟹共设6个处理组,每个处理组60只蟹。结果表明:青蟹增重率和特定生长率随饲料中豆油替代水平升高均呈减低趋势,其中SO60、SO80和SO100三个处理组显著低于其他处理组（P<0.05）;综合考虑,豆油最佳替代量不宜超过40%。肝胰腺中SO60、SO80和SO100组粗脂肪含量显著上升（P<0.05）,肝胰腺中SO0组的粗蛋白含量显著高于SO20、SO40和SO60组。肌肉组织中,粗脂肪含量总体上随着饲料中豆油替代水平的上升而下降;肝胰腺EPA含量随着豆油替代鱼油比例的升高而逐渐降低,最低值出现在SO100处理组,DHA含量在各处理组之间没有显著性差异（P>0.05）。肌肉组织中,SO0和SO20组中EPA含量显著高于其他试验组（P<0.05）,SO0组中DHA含量显著高于SO80和SO100试验组（P<0.05）。肌肉和肝胰腺中HUFA含量与饲料脂肪酸中C18:2n-6含量呈现负相关,肝胰腺中C18:2n-6和HUFA含量与肌肉中的含量均呈现正相关;肝胰腺中甘油三酯含量、脂蛋白脂酶和肝脂酶活性在各处理组之间差异不显著（P<0.05）。2.饲料中豆油替代鱼油对拟穴青蟹脂肪酸代谢相关基因的影响随着大豆油替代鱼油比例的升高,肝胰腺中脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）和乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl Co A carboxylase,ACC）的表达水平均呈现上升趋势。替代比例达到80%和100%时,肝胰腺FAS基因的表达水平相对于SO0分别上调2.48倍和2.23倍,ACC基因分别上调2.25倍和2.53倍,均与SO0组间有显著性差异（P<0.05）。肌肉组织中,各处理组间FAS基因表达水平差异不显著（P>0.05）,ACC基因SO80和SO100处理组相对于SO0组分别上调1.98倍和1.71倍（P<0.05）;肝胰腺和肌肉组织中SO0和SO20处理组中脂肪酸结合蛋白3（fatty acid binding protein,FABP3）基因表达水平显著低于其它处理组（P<0.05）,脂肪酸转运蛋白（fatty acid transporter protein,FATP）基因的m RNA表达水平随着饲料中豆油替代比例的增加呈先上升后下降的趋势,其中SO60和SO80处理组显著高于其他处理组（P<0.05）。肌肉组织中的FATP基因表达水平在SO0组显著低于其它处理组（P<0.05）,FABP9基因的m RNA整体表达水平随着豆油替代比例的增加而上升。肝胰腺中,替代比例达到80%和100%时,脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase,LPL）基因表达水平显著降低（P<0.05）,替代水平比例达到60%、80%和100%时,肉碱脂酰转移酶I（carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-1）基因表达水平显著降低（P<0.05）;肌肉组织中,SO0处理组CPT1基因的m RNA表达水平显著低于SO40、SO60、SO80和SO100处理组（P<0.05）。3.拟穴青蟹Δ6Fad基因的启动子克隆和生物信息学分析克隆获得Δ6 Fad启动子区序列共3258bp,其中包括第二个外显子的部分序列（ATG上游,70bp）、第一个内含子（228bp）、第一个外显子（126bp）和第一个外显子上游序列（2833bp）。启动子预测网站进行分析结果表明,该序列有启动子特征,并且有多个可能与脂类代谢有关的组件,包括:NF-1、HNF-4、CEBPB、SREBP、Sp1、AP1和P53等,并在-958～-856bp处发现一个102 bp的Cp G岛。4.SREBP-1基因的c DNA全长克隆及生物信息学分析克隆获得固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory element-binding protein,SREBP）转录因子c DNA全长3361bp（不包括Poly A尾）（Gen Bank登录号:MH910503）,包括118bp的3’非翻译区,123bp的5’非翻译区以及3202bp的开放阅读框,共编码1039个氨基酸。SREBP-1基因的氨基酸序列比对发现,具有典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构（b HLH-zip）,通过氨基酸序列相似性比较发现,拟穴青蟹SREBP-1氨基酸序列与克氏原螯虾的相似度最高,为61.17%,与斑马鱼和大西洋鲑的相似度分别为31.84%和32.57%,与人、小家鼠、原鸡的相似度在11.07-33.30%之间。组织表达谱结果显示,SREBP-1基因在检测的所有组织中均有表达,脑神经节和眼柄中表达量最高且与其他组织差异显著（P<0.05）,其次是肝胰腺、心脏、鳃和肠的表达量较高,在肌肉、胸神经节和胃中的相对表达量较低。5.饲料中豆油替代鱼油对拟穴青蟹Δ6 Fad和SREBP-1基因m RNA表达的影响随着大豆油替代鱼油比例的升高,肝胰腺中Δ6 Fad基因表达水平呈现上升趋势。当替代比例达到80%和100%时,Δ6 Fad基因表达水平相对于SO0处理组分别上调2.76倍和2.58倍（P<0.05）。肌肉组织中,替代比例达到20%和40%时,Δ6 Fad基因相对表达水平最高,与SO0处理组差异显著（P<0.05）,但与SO60、SO80和SO100处理组间无显著性差异（P>0.05）。肝胰腺中,替代比例达到80%和100%时,与SO0处理组相比,SREBP-1基因表达水平分别上调2.25倍和2.87倍（P<0.05）;肌肉组织中SREBP-1基因表达整体水平随着豆油替代水平的增加而升高,替代比例达到60%、80%和100%时,与SO0组相比,分别相对上调了2.03倍、1.86倍和2.13倍（P<0.05）。不同比例豆油替代鱼油的饲料对青蟹肝胰腺中Δ6 Fad、SREBP-1基因表达量的影响要比在肌肉组织中显著。综上所述,本论文的研究结果显示:（1）饲料中不同比例豆油替代鱼油对生长具有一定的影响,对肝胰腺体成分及脂肪酸组成具有显著影响;在油脂添加8%的基础上,豆油替代鱼油比例不宜超过40%。（2）脂肪酸合成、转运相关基因整体表达水平上升,分解相关基因表达量下调。肌肉组织中各基因的表达水平变化整体上与在肝胰腺中一致。（3）Δ6 Fad启动子区含有保守的NF-Y、SREBP结合位点,在此基础上克隆了转录因子SREBP-1,并研究了其在豆油替代鱼油的表达效果。肝胰腺中Δ6 Fad和SREBP-1基因的表达量随着豆油替代鱼油比例的升高而升高,且肝胰腺中Δ6 Fad、SREBP-1基因表达量的影响要比对肌肉组织中的影响大。