动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是慢性炎症反应和免疫性疾病,是冠心病的主要病理基础。在AS斑块中可发现大量的T淋巴细胞,其中以CD4+T淋巴细胞为主,CD4+T淋巴细胞亚群的失衡与急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)发生关系密切。易损斑块中大量活化的T淋巴细胞降低斑块的稳定性,使斑块易于破裂。不稳定型心绞痛(Unstable angina pectoris,UAP)的患者及急性心肌梗死患者,心肌微血管内存在血小板血栓,在心肌微循环水平形成微栓塞,导致心肌微梗死。因此,CD4+T淋巴细胞可能间接的参与了ACS患者心肌损伤的过程。术后心肌损伤仍然是经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)常见的并发症,但其机制目前尚不完全清楚。有研究表明,PCI术前大剂量的他汀可以有效的降低炎症因子水平,保护心肌。因此,炎症和免疫反应也是PCI术后心肌损伤的重要原因之一。还有研究表明,PCI对血管壁的损伤可以导致外周血淋巴细胞的显著激活和氧化应激产物标志物的显著增高,外周血激活的CD4+T淋巴细胞表达的CD18分子可促进白细胞招募并粘附于受损的内皮细胞。因此,炎症反应及以CD4+T淋巴细胞介导的免疫反应直接参与了PCI术后心肌损伤的过程。微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)是一类长约18～25个核苷酸的小分子RNA。近年来发现,miRNA也参对与AS发生发展密切相关的炎性细胞如单核/巨噬细胞、淋巴细胞及内皮细胞的调控。虽然目前miRNA在T淋巴细胞调控中的研究取得了重大的进展,但仍属于起步阶段,并且在不同的疾病状态和疾病发展的不同阶段,miRNA表达和作用亦不尽相同,与T淋巴细胞活化和功能调控相关的miRNA在UAP及PCI术后心肌损伤中的生物学功能尚未阐明。本研究拟通过miRNA基因芯片技术筛选出UAP患者外周血CD4+T淋巴细胞异常表达的miRNA,阐明异常表达的miRNA对CD4+T淋巴细胞活化、分化及功能调控的机制。同时探讨miRNA在PCI术后的变化及与心肌损伤相关性。目的:通过检测UAP患者循环血CD4+T淋巴细胞中基因的miRNA表达谱,筛选与正常对照者差异表达的miRNA,寻找对CD4+T淋巴细胞具有调控作用的miRNA,为进一步阐明miRNA在UAP发病机制中的作用提供基础。方法:选取入住我院的典型UAP患者3例,以疑似不典型冠心病症状而冠脉造影正常的住院患者3例作为正常对照组,抽取新鲜外周静脉血20ml。利用密度梯度离心法分离出UAP患者和正常对照者循环血中的单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),免疫磁珠法(Magnetic cell sorting system,MACS)进一步分离出CD4+T淋巴细胞。采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测所分离CD4+T淋巴细胞的纯度,台酚蓝检测活细胞数。Trizol一步法提取细胞总RNA,取40μg总RNA,用聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)方法分离纯化miRNA。用分光光度计测定RNA的浓度,甲醛变性胶电泳质检RNA的质量。采用Affymetrix miRNA基因表达谱芯片进行杂交,检测CD4+T淋巴细胞miRNA的表达谱。用Affymetrix GeneChip Scanner 3000基因芯片扫描仪进行图像扫描,Affymetrix GeneChip Command Console? 1.1图像分析软件对图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,然后用SAM软件(版本3.02)处理数据,筛选出UAP患者和正常对照者CD4+T淋巴细胞差异表达的miRNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,real time PCR)对部分差异表达的miRNA进行验证。结果:miRNA基因芯片筛选结果显示,相对于正常对照者,UAP患者外周血CD4+T淋巴细胞中表达显著上调的miRNA有miR-155, miR-21, miR-424和miR-127-3p,显著下调的有miR-30b和miR-181a。real time PCR进一步验证的结果表明,上述差异表达miRNA的变化趋势及变化倍数与miRNA基因芯片筛选结果一致。结论:筛选得到的UAP患者循环血CD4+T淋巴细胞miRNA差异表达谱,可能与参与了UAP的发生发展。目的:通过研究微小核糖核酸-155(miRNA-155)对UAP患者外周血CD4+T淋巴细胞的调控作用,从而揭示miRNA-155在UAP发病中的作用机制。方法:选取入住我院的UAP患者10例,抽取新鲜外周静脉血。采用密度梯度离心法分离出UAP患者PBMC,MACS法进一步分离出CD4+T淋巴细胞,用无血清RPMI1640培养基调整为2×106/ml,随后分为四组:对照组、miRNA-155模拟体组和阻遏物组,以另一孔转染荧光对照的FAM-siRNA作为荧光对照。对照组加入阴性对照的模拟体(终浓度为50nM),miRNA-155模拟体组中加入的为miRNA-155模拟体(终浓度为50nM),阻遏物组加入的miRNA-155模拟体和miR-155阻遏物(终浓度分别为50nM),同时加入脂质体2000,共转染5h。随后加入植物凝血素刺激CD4+T淋巴细胞活化后,收集细胞及上清。流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞Th1和Th2亚群数量,提取CD4+T淋巴细胞总RNA和蛋白,real time PCR检测γ干扰素受体α链(Interferon-gamma receptor alpha chain,IFN-γRα)、T细胞表达的T盒(T box expressed in T cells,T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA-3)mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测IFN-γRα、T-bet、GATA-3蛋白的表达;酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养液上清γ干扰素(Interferon-gamma,IFN-γ)、白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)的表达。对IFN-γRα与IFN-γ、IL-4的表达进行直线相关性分析。结果:流式细胞检测结果显示,miRNA-155模拟体组的IFN-γ阳性CD4+T淋巴细胞计数较对照组显著增加[(63.19±8.61)% vs (47.17±10.28)%,P<0.01] ,阻遏物组较miRNA-155模拟体组降低[(52.87±10.05)% vs (63.19±8.61)%,P=0.024]。三组间IL-4阳性CD4+T淋巴细胞计数无明显差异(F=0.228,P=0.798)。与对照组比较,miRNA-155模拟体组T-bet mRNA表达显著增加(P<0.01),与miRNA-155组比较,阻遏物组T-bet mRNA表达降低(P<0.01);三组间IFN-γRα、GATA-3的mRNA表达无明显差异(分别F=1.055,P=0.362; F=1.601,P=0.220)。与对照组比较,miRNA-155模拟体组IFN-γRα蛋白表达显著减少,T-bet蛋白表达显著增加(均P<0.01);与miRNA-155模拟体组比较,阻遏物组IFN-γRα蛋白表达增加,T-bet蛋白表达减少(均P<0.01);三组间GATA-3蛋白表达无明显差异(F=0.098, P=0.907)。与对照组比较,miRNA-155模拟体组的IFN-γ显著增高(P<0.01),阻遏物较miRNA-155模拟体组降低(P<0.01);三组间IL-4表达无明显差异(F=0.384,P=0.685)。相关分析表明,IFN-γRα蛋白表达与IFN-γ表达呈显著负相关(r=-0.775,P<0.01),与IL-4表达无相关关系(r=0.041,P=0.832)。结论:miRNA-155主要通过影响Th1细胞的分化和功能,参与对CD4+T淋巴细胞的调控,在UAP发病中起重要的作用。miRNA-155的作用可能部分与调控靶基因IFN-γRα的表达有关。目的:初步探讨异常表达miRNA-155与UAP患者在PCI术后心肌损伤关系,为进一步阐明miRNA在PCI术后心肌损伤机制中的作用提供理论基础。方法:选取2010年1月至12月入住我院并行PCI的UAP患者41例,其中PCI术后肌钙蛋白升高超过正常参考值3倍20例,肌钙蛋白正常者21例,同时以18例疑似不典型冠心病症状而冠脉造影正常的住院患者为正常对照组。Real time PCR检测患者循环血CD4+T淋巴细胞miRNA-155在PCI术前和术后12h的表达水平,western blotting检测术前和术后12h IFN-γRα蛋白的表达,ELISA法测定PCI术前和术后12h血清IFN-γ和IL-4的表达。对miRNA-155的表达水平和IFN-γRα蛋白、血清IFN-γ和IL-4进行相关性分析。结果:UAP患者术前miRNA-155、IFN-γ明高于对照组(均P<0.01),IFN-γRα蛋白表达低于对照组(均P<0.01),IL-4表达无差异(均P>0.05)。术前肌钙蛋白阳性组miRNA-155、IFN-γRα蛋白和IFN-γ表达水平与肌钙蛋白阴性组无明显差异(均P>0.05);术后12小时,肌钙蛋白阳性组与肌钙蛋白阴性组的miRNA-155、hsCRP、IFN-γ表达均显著增高(均P<0.05),且肌钙蛋白阳性组较肌钙蛋白阴性组增高更为明显(P<0.05);IFN-γRα蛋白表达显著低于(均P<0.01),肌钙蛋白阳性组较肌钙蛋白阴性组降低更为明显(P<0.01)。两组术前、术后血清IL-4水平无明显差异。术前、术后miRNA-155表达与IFN-γ呈显著正相关(分别r=0.649,P<0.01;r=0.682,P<0.01),与IFN-γRα蛋白表达呈显著负相关(分别r=-0.536,P<0.01;r=-0.592,P<0.01),与IL-4无明显相关关系(分别r=-0.165,P=0.303;r=0.107,P=0.506)。结论:miRNA-155参与了UAP患者中Th1细胞活化及细胞因子IFN-γ分泌的调控过程;miRNA-155表达与PCI术后心肌损伤存在明显的相关关系,miRNA-155可能参与了PCI术后心肌损伤的免疫调控过程。