Mycolata类放线菌，是一类细胞壁含有分枝菌酸特殊包被结构，并具有代谢甾醇作为其碳和能量来源能力的微生物。前期，本课题组通过对新金分枝杆菌（Mycobacteriumneoaurum ATCC25795）甾醇代谢途径的改造，得到多株可转化甾醇积累重要甾体药物中间体（C19甾体化合物和C22甾体化合物）的工程菌株。然而，利用这些工程菌株转化的底物投料量、摩尔转化率等核心参数，仍不能很好的满足工业生产要求。因此，有必要发掘新的研究思路和改造方案，一方面，继续解析分枝杆菌代谢甾醇过程中的未解机制;另一方面，尝试进一步提升甾药中间体生产菌株的生产效率。　　1.分枝杆菌甾醇代谢适应性机制的研究　　借助第二代测序系统，对M.neoaurum ATCC25795基因组进行重测序，发现该菌中同样存在两个与Mycobacterium tuberculosis基因组类似的甾醇摄取和代谢基因簇。利用同源重组技术，将该M.neoaurum菌株甾醇代谢途径阻断于侧链降解和母核降解间的几个步骤，构建可分别积累雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，和9α-羟基-雄甾-4-烯-3，17-二酮（9-OHAD）等重要甾体药物中间体的工程菌株（ΔkshA1，ΔkstD1和ΔkshA1&hsd4A）。通过RNA测序对比其与野生型菌株间的转录水平差异，发现改造菌株在积累目标甾药中间体时，其中心碳代谢途径关键酶基因转录普遍受到抑制(zwf，gntZ,pfkB，pyk，citA，icd2，kdg等)，而甾醇代谢途径未被阻断的侧链代谢途径相关酶基因转录普遍增强(kstD2，kshA2，fadE28-29，echA19，fadD19，ltp2等)。增强的甾醇侧链代谢效率，意味着产生相对更多的丙酰-CoA、乙酰-CoA等短链分子，其中丙酰-CoA过量积累对细胞有毒害作用。然而，在丙酰-CoA的三条脱毒途径中:(a)细胞被膜分枝菌酸等脂质成分的合成和组装明显受到抑制（下调约2.3-4.0倍）;将丙酰-CoA进行无害转化所需借助的(b)柠檬酸甲酯循环(MCC)（转化得到琥珀酸）和(c)甲基丙二酰途径(MMP)途径(转化得到琥珀酰-CoA)的代谢效率，似乎表现出一定幅度的增强(MCC和MMP途径终产物琥珀酸和琥珀酰-CoA，对应的琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)和琥珀酰-CoA合成酶基因(sucBCD)的转录水平，均出现显著上调），意味着相对过量的有毒代谢产物丙酰-CoA，似乎主要通过(b)(c)两条途径得到降解。综上所述，当分枝杆菌中起关键作用的甾醇代谢途径部分受损时，很可能会激活细胞的一种自适应调节机制，从而实现维持菌体内部代谢流和能量供应的平衡。　　2.抑制分枝杆菌细胞被膜的组装对细胞通透性和甾药中间体产量的影响　　Mycolata类微生物细胞膜外的分枝菌酸被膜结构，为菌体细胞提供了一个致密的屏障层，然而该结构却严重影响了相关工程菌株对甾醇底物的利用效率。为提高分枝杆菌工程菌株对甾醇的代谢效率，通过试删除与分枝杆菌细胞被膜合成相关的一些转运蛋白基因，筛选删除后细胞通透性和甾醇利用速率得到显著提升的改造菌株。结果发现，在野生型M.neoaurum ATCC25795中删除mmpL3基因，细胞通透性提升约23.4％，细胞对甾醇的利用速率提升约15.6％。随后，在4-HBC(22-羟基-23，24-去甲胆甾-1，4-二烯-3-酮，22-hydroxy-23，24-bisnorcho1-4-ene-3-one)生产菌株中，删除mmpL3基因，使4-HBC产量提升约24.7％。另外，结合经典代谢工程策略，分别过表达甾醇侧链代谢途径中的部分关键酶基因（choM1，choM2，cyp125和fadA5），产物产量得到普遍提升。最后，在删除mmpL3的工程菌株中，对提升效果比较显著的choM1，cyp125和fadA5基因进行组合共表达，4-HBC产量从最初的6.31 g/L，提升到7.59 g/L(20 g/L植物甾醇(95％)底物投料量）。　　3.改造Sigma因子相关基因对甾药中间体产量的影响　　微生物基因的表达调控，通常发生在转录水平，Sigma因子在此过程中发挥着非常关键的作用。为分析Sigma因子是否参与转化甾醇积累甾药中间体过程的调控，在上述RNA测序信息中，我们对Sigma因子在不同工程菌株中的转录情况进行分析发现，在可积累产物的工程菌株中，部分Sigma因子转录水平出现大幅度上调或下调。通过试删除转录差异较大的Sigma因子相关基因发现，缺失sigD基因的9-OHAD生产菌株，产量出现明显提升(18.9％)。同时，通过删除“Rip1（抗-抗-Sigma因子）-RsdA（抗-SigD因子）-SigD因子”调控通路上游的蛋白水解酶基因rip1，9-OHAD产量提升约27.3％。qRT-PCR分析结果显示，删除rip1或sigD基因，甾醇代谢途径部分关键酶基因的转录水平都出现上调，暗示Rip1和SigD可能是影响甾醇代谢途径效率的负调节因子。缺失rip1基因，解除了Rip1-RsdA-SigD调节通路对转化甾醇积累甾体药物中间体过程的转录抑制调节，从而使相应产物产量得到提升。　　本论文从基因组、转录组和蛋白组层面，对分枝杆菌代谢甾醇途径进行比较系统的解析，揭示了分枝杆菌可能存在的一种自适应调节机制。在此基础上，筛选鉴定了数个影响甾醇转化效率的基因，提出改进甾醇转化工程菌株的新策略，解除影响工程菌株产物产率的部分限制因素，并结合基因工程、代谢工程等经典方法，最终实现对相关工程菌株生产核心甾体药物中间体产率和产量的提高。本论文提出的工程菌株改造策略具有较好的推广潜力，同时，所构建的高效、稳定的甾药中间体微生物转化工程菌株，进一步加强了我国甾体药物生产行业的技术储备，并可在一定程度上推动相关产业的技术进步和升级。