多倍化现象在自然界,尤其是植物中广泛存在,其在新物种形成和物种进化的过程中具有重要的意义。相较于二倍体,多倍体具有明显的优势,如快速生长,不育,抵抗能力强等。近年来多倍化已经被广泛应用于农业,林业,渔业和畜牧业等,因此多倍化现象的研究不仅有利于研究多倍化在生物进化理论中的重要作用,对于动植物中的多倍体育种也具有重要的指导意义。尽管通过不同的诱导方式产生多倍体已经在植物中获得了成功,但是在动物中通过诱导细胞的多倍化来获得多倍体动物却相对较少。尤其在鱼类中,通过体外诱导和流式细胞仪分选纯化的方式获得稳定的纯的多倍体细胞系或者四倍体细胞系还未见报道。多能干细胞对于研究发育生物学中的关键问题具有重要的作用,可以作为研究转基因动物模型的重要工具细胞。本论文综合运用细胞培养技术、多倍体诱导技术、体细胞核移植技术和iPS诱导技术,分别进行了通过SP600125诱导鲫鱼细胞多倍化来获得稳定的具有发育功能的四倍体鲫鱼细胞系以及通过iPSC诱导技术将斑马鱼的成纤维细胞诱导成多能性的干细胞(iPSC)的相关研究。具体来说,本论文主要进行了以下几个方面的研究。1、SP600125诱导鲫鱼细胞多倍化及建系以二倍体鲫鱼尾鳍组织为材料,利用细胞培养技术,通过建立和优化SP600125体外诱导多倍化方法以及流式分选体系,我们成功获得了四倍体鲫鱼细胞系。获得的四倍体鲫鱼细胞系在培养过程中经过多次流式分析和核型鉴定都是四倍体细胞。2、诱导获得的四倍体鲫鱼细胞的发育潜能研究运用体细胞核移植技术,我们以建立的四倍体鲫鱼细胞系的四倍体细胞核为供体,去膜的二倍体鲫鱼未受精卵为受体进行核移植。共进行了 6批核移植,操作了 922枚鲫鱼的未受精卵,其中有420枚发育到囊胚,73枚发育到原肠晚期,获得了一尾尾部畸形鱼苗。而在对照组中(未进行核移植的去膜二倍体鲫鱼未受精卵),922枚材料中没有一枚发育到囊胚期。通过流式细胞仪检测分析核移植获得的重构胚的DNA含量情况,结果表明其是四倍体胚胎。3、利用体细胞重编程技术将斑马鱼的成纤维细胞诱导成多能性干细胞(iPSC)首先通过体外建立稳定的斑马鱼胚胎成纤维细胞系和尾鳍成纤维细胞系。然后通过病毒感染的方式向斑马鱼的胚胎成纤维细胞系和尾鳍成纤维细胞系中导入外源基因oct4,sox2,klf4和c-myc,建立了诱导多能性干细胞系(iPSC)。对斑马鱼胚胎和尾鳍成纤维细胞诱导后获得的诱导多能性干细胞系(iPSC)进行碱性磷酸酶活性检测,结果呈阳性。免疫细胞荧光染色鉴定也表明,所获得的斑马鱼胚胎诱导多能性干细胞系(iPSC)表达OCT4、SSEA1、NANOG、SOX2;而斑马鱼尾鳍成纤维诱导所得的iPSC只表达OCT4。同时,斑马鱼胚胎成纤维感染病毒后获得的iPS细胞能分化成具有内、中、外三胚层的类似早期三胚层胚胎的结构的拟胚体(拟胚体的形成是研究干细胞体外分化能力的指标),且RT-PCR鉴定分析表明其具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。这些鉴定结果都直接证明,通过我们的诱导方法获得的斑马鱼iPSC是具有多能性的,并且不同体细胞来源所诱导得到的细胞的多能性具有差异。综上所述,在本文中,通过小分子化合物SP600125体外诱导二倍体鲫鱼细胞多倍化,进一步通过流式细胞仪分选纯化获得了四倍体鲫鱼细胞系;我们发现SP600125诱导多倍化过程不通过Jnk信号通路,而p53信号通路可能参与了这个诱导过程;用SP600125诱导的四倍体细胞的细胞核作为供体,二倍体鲫鱼未受精的卵为受体,通过核移植获得了四倍体胚胎。这些结果表明通过将体细胞诱导多倍化和体细胞核移植技术相结合是产生多倍体的一种有效方式。本研究通过体外建立稳定的斑马鱼胚胎成纤维细胞系和尾鳍成纤维细胞系,以病毒感染的方式向斑马鱼的胚胎成纤维细胞系和尾鳍成纤维细胞系中导入外源基因(oct4,sox2,klf4和c-myc)建立了鱼类诱导多能性干细胞系(iPSC),为体细胞重编程辅助育种技术的研发奠定了基础,同时也为鱼类发育生物学的研究提供了一个非常有用的细胞系工具和研究平台。