乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染仍旧是中国乃至全球极为重大的公共卫生与健康问题,平均每年死于该病毒感染的人口大约有一百万。目前全世界累计有20亿左右的人口感染过或者正在感染HBV,其中有3500万人属于慢性乙肝患者,肝脏内病毒的复制与病毒复制所诱导的长期炎症反应使得这些人群更加容易受到肝硬化,肝癌和肝衰竭等疾病的严重威胁。据悉,全世界超过50%的肝癌都是由HBV感染造成的,其中丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)和HBV共同感染的患者的病情恶化尤为快速和严重。尽管有高效的疫苗和一定的治疗手段,乙型肝炎的防治工作任重而道远,现有的防治体系仍面临着巨大的挑战,同时HDV感染的治疗手段也是很缺乏的。因此,对HBV的基础研究急需进一步深入和加强,其中HBV对细胞早期入侵过程中的分子机制的探索和研究显得尤为迫切和重要。在体内HBV只能感染人,黑猩猩和类灵长类小动物树鼩(Tupaia belangeri chinenesis, Northern Treeshrew)。可以被HBV体外感染的细胞只有少数几种,其中原代树鼩肝细胞(Primary Tupaia Hepatocyte, PTH)是目前为止可以作为研究HBV感染的一个重要细胞模型。另外,HBV的卫星病毒HDV和与其紧密相关的绒毛猴乙型肝炎病毒(Woolly Monkey Hepatitis B virus, WMHBV)也能感染PTH,它们是研究HBV细胞早期入侵的分子机制的有力工具。分离高品质的PTH以及建立高效的HBV, HDV和WMHBV的PTH感染体系,对HBV入侵细胞分子机制的探索研究是极为关键的,对于HBV入侵细胞的功能性受体及其相关性分子的探索研究也起着不可或缺的决定性作用。经过持续不断的努力奋斗和追求,我们建立了十分优良的PTH分离培养体系和十分高效的PTH对HBV, HDV和WMHBV的体外感染体系。并且,在不断改进和优化该系统的过程中,我们同时试图寻找能够在HBV感染的不同时期内抑制或促进感染的功能和靶向蛋白已知的小分子化合物,以便结合化学-生物学的手段对HBV早期入侵机制进行研究。由于树鼩基因组序列并不完全,以及树鼩特异抗体等研究试剂比较缺乏,考虑到小分子化合物的活性一般不会在PTH内受到较大的限制,因此基于PTH体外感染体系来进行活性已知的小分子化合物筛选可以比较有效地帮助我们全面系统地了解HBV入侵的分子机制。通过筛选大量的小分子化合物,我们发现了受体酪氨酸激酶-磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B (RTK-PI3K-AKT)这条十分重要的信号转导通路参与了HBV入侵细胞的早期进程。同时我们尝试并研究了以HBV前S1段(pre-S1)区为配体来寻找其受体的免疫共沉淀策略。我们探索了紫外光共价交联,结合免疫印迹来追踪可能的功能性受体复合物的方法,和利用LC/MS/MS (IP-Western-LC/MS/MS)来鉴定银染条带中目标蛋白的技术策略和路线。这种策略可以有效发现并特异追踪十分微量的目标蛋白,而且蛋白构象变化对目标蛋白的检测并无影响,可以在蛋白完全变性的情况下进行。我们的一些前期研究结果说明已有的树鼩肝脏转录组数据库的质量不能满足在我们受体研究工作中所必须的高特异性的质谱鉴定需要。这些努力和尝试为我们提供了以HBV pre-S1区段为配体寻找其受体的丰富的正反两方面的重要经验,为实验室最终通过近零距离紫外光交联反应找到该特异性受体打下了宝贵的基础。在相关的部分工作中,通过preS1区为靶蛋白的免疫共沉淀实验我们发现并随后部分验证了与细胞膜表面相关的肌球蛋白重链9(Myosin9)有可能作为WMHBV入侵PTH所需要的一个细胞因子。在我们实验室发现钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide, NTCP)是HBV,HDV和WMHBV共同的功能性受体后,我们认为我们早先发现的RTK-PI3K-AKT通路很有可能是通过调节NTCP的细胞内定位来参与病毒的早期入侵进程的。最后,为证明NTCP在体内也是HBV, HDV和WMHBV的功能性受体,我们在几个月的时间内建立了人NTCP的转基因小鼠品系,通过免疫印迹和免疫荧光染色等一系列实验验证了人NTCP在转基因小鼠肝脏中的高效率表达。目前正在紧锣密鼓地进行病毒感染相关的功能性实验。