论文部分内容阅读
解旋酶是一种以ATP为能量来源,按照3’→5’或5’→3’方向解开双链或有结构的DNA或RNA的分子马达,它广泛存在于生物体内,并参与染色体和质粒的复制、转录与翻译、DNA的重组与修复过程。RECQ属于解旋酶SFII超家族,它在不同物种中高度保守,是基因组的保护者。RECQ解旋酶家族的RECQL在维护基因组稳定性方面发挥重要作用,并参与染色体复制,DNA修复,端粒的维护等多个过程,但目前对RECQL研究的并不充分,对酶的工作状态,反应过程动力学,结构机制仍缺乏了解。本研究以牛(Bos taurus)Recql基因为研究材料,通过原核表达系统,获得了高纯度的全长(BtRECQL)、截短(BtRECQLT)和突变(BtRECQLTM)蛋白,并对BtRECQLTM的聚集状态和与DNA的结合活性进行了分析,对BtRECQL的解旋条件进行了优化,在此基础上比较了BtRECQL、BtRECQLT和BtRECQLTM对不同底物的解旋活性。获得了以下成果:1.人工合成了优化过编码序列的Bt Recql全长基因,成功构建了p ET21a-Bt Recql表达载体,将载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。经过Ni柱的粗提取和分子筛的精细纯化,获得了纯度大于95%的BtRECQL全长蛋白,1 L菌液可获得约0.29 mg全长蛋白。2.在Bt Recql全长序列的基础上,构建了截短蛋白的表达载体p ET15b-Bt Recql T。在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达后,经过Ni柱粗提取和分子筛精细纯化,发酵1 L LB培养基,可获得约3.1 mg纯度大于95%的BtRECQLT截短蛋白。3.在Bt Recql T序列的基础上,构建了突变蛋白的表达载体p ET15b-Bt Recql TM。同样在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,采用与BtRECQLT相同的纯化方法,1 L菌液最终可获得0.84 mg纯度大于90%的BtRECQLTM突变蛋白。4.通过动态光散射(DLS)实验对BtRECQLTM的聚集状态进行分析发现,不管是否有ATP或DNA存在,BtRECQLTM均以单体的形式存在。对BtRECQLTM与不同底物亲和力进行研究发现,BtRECQLTM对单链DNA的亲和力比对双链DNA的强,另外,对同一种类型的DNA底物,随着链的增长BtRECQLTM对其的亲和力呈逐渐增加的趋势。对G4 DNA而言,带尾链的比不带尾链的更容易与BtRECQLTM结合。5.通过荧光共振能量转移并结合停流光谱技术对BtRECQL解旋活性进行研究,发现BtRECQL在蛋白浓度为60 nmol/L,反应条件为1 mmol/L ATP,30 mmol/L Tris-HCl p H7.5,60 mmol/L Na Cl,1 mmol/L Mg Cl2,2 mmol/L DTT,反应温度为37℃时,解旋活力较好。6.在优化好的解旋条件下,分别测定BtRECQL、BtRECQLT、BtRECQLTM对双链DNA和G4 DNA的解旋活性,结果均是BtRECQLT的解旋活性最强,BtRECQL的解旋活性最弱,说明RECQL解旋酶主要在二聚体形式下发挥解旋功能,多聚状态不利于RECQL发挥解旋功能。本研究成功构建并表达纯化出高纯度的BtRECQL全长、截短和突变蛋白,对突变蛋白BtRECQLTM的相关理化性质进行了研究,优化出BtRECQL最佳解旋条件,并在最佳解旋条件下比较了BtRECQL、BtRECQLT、BtRECQLTM对双链DNA和G4 DNA的解旋活性,为RECQL结构和功能的研究奠定了基础。