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孔雀石绿(Malachite Green, MG)是一种三苯甲烷类化合物,工业生产中主要用于纸张、皮革、丝绸、羊毛、陶瓷的染色,生物学研究中也作为细胞、组织的一种染色剂,过去还被用于食品添加剂。20世纪30年代开始用于水产养殖业,对水霉病、鳃霉病和体内外寄生虫感染有特效,另外在运输或市场交易、饭店水族箱饲养过程中常作为保鲜剂使用,可防止鱼体碰撞损伤、鳞片脱落后霉烂死亡,保持鱼类色泽鲜亮。但孔雀石绿具有致畸、致癌和致突变的特性,其进入生物体后的主要代谢物无色孔雀石绿(Leucomalachite Green, LMG)是脂溶性物质,残留时间长,不易排出,具有很强的生物毒性。许多国家和地区已禁止将孔雀石绿用于水产养殖各环节中,我国也规定孔雀石绿及其代谢物不应出现在任何动物性产品中。目前用于检测孔雀石绿及其代谢物残留的方法很多,主要有高效液相色谱检测法(HPLC)、色谱-质谱联用检测法、色谱-荧光光度法、色谱-分光光度法、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫检测法(CGIA)、拉曼光谱法、电化学方法、共振瑞利散射法和分子印迹整体材料法等。其中一些检测方法虽可用于MG残留检测,且基本能满足国家规定检测标准,但有样品前处理复杂、成本高、检测时间长或对操作人员有较高专业技术要求等缺点,不适合实际生产生活中MG及其代谢物的残留检测,因而较难推广。而ELISA方法有操作简单、成本低、特异性强和高效的特点,适于大批量样品快速检测,更易推广应用。本研究以单克隆抗体制备和酶联免疫吸附检测技术为基础,利用小分子与蛋白质连接技术合成人工抗原,制备出同时针对MG及其主要代谢物LMG的单克隆抗体,建立检测MG和LMG残留的ELISA检测方法。1.LMG人工抗原的合成与鉴定。通过结构改造、重氮化将LMG与BSA偶联,合成免疫原；然后通过化学反应、碳二亚胺法合成LMG-OVA,作为包被原。通过紫外扫描吸收峰偏移情况和免疫学方法初步判断LMG与载体蛋白偶联成功。利用考马斯亮蓝法测得LMG-BSA和LMG-OVA蛋白浓度分别为2.4mg/mL和2.0mg/mL。2.LMG单克隆抗体的制备。用LMG-BSA作为免疫原常规免疫雌性BALB/c小鼠,第五次免疫后7d尾静脉采血检测抗体效价为1：30,000以上。加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过HAT选择培养基和酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法亚克隆后最终筛选出3株能分泌抗LMG和MG的特异性抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B11、1E5和4B7,其中1B1l和1E5所制腹水抗体效价较好,分别为1：16,000和1：32,000。蛋白浓度分别为31.69mg/mL和28.89mg/mL。o3. ELISA检测方法的建立。利用1E5杂交瘤细胞制得的小鼠腹水,建立检测MG和LMG残留的间接竞争ELISA法。包被原最佳稀释浓度为1：8,000,腹水最佳工作浓度为1：16,000。利用LMG作出药物抑制标准曲线,其线性方程为y=0.4586x-0.1801(R2=0.9954),半抑制浓度IC50为30.4ng/mL,检测下线LOD低于2.5ng/mL,定量限LOQ为5.17ng/mL。交叉实验表明,该单抗对LMG的抑制率为100%,与MG的交叉反应率为71.4%,与副品红、甲基蓝、结晶紫、氯霉素和罗丹明B等无交叉反应。4.模拟实验。通过模拟实际生产中孔雀石绿的使用,获得残留有LMG的样品,同时设空白对照组。对样品前处理,当样品处理液稀释6倍时,样品基质干扰基本消失,在5～200ng/mL范围内建立CiELISA标准曲线的线性方程为y=0.4628x-0.191(R2=0.9947),测得实验组样品中LMG含量为0.501mg/kg。