自发性脑出血(Spontaneous intracerebral hemorrhage, ICH)是一种常见的中风亚型,发病后情况往往很严重,其死亡率高达40%以上,而且生还者往往有明显的神经功能损伤。脑出血后脑损伤的机制很复杂,目前认为：1)初始的物理损伤以及血肿占位效应；2)凝血酶；3)血红蛋白以及其降解产物；4)炎性介质与补体为四个比较明确的主要原因。蛋白激酶受体1(protease activated receptor-1, PAR1)是一种重要的凝血酶受体,与脑出血后的脑损伤密切相关。同时,凝血酶及其受体PAR1又被认为与脑出血后的脑康复有密切联系。但这些目前都还缺乏更加直接的证据和深刻的研究。本文通过动物实验结合离体实验的方法,进一步研究：1)细胞的自噬性死亡在凝血酶导致的脑损伤过程中是否存在和相关作用；2)应用基因敲除技术得到的动物模型,获得PAR1在凝血酶导致脑损伤过程中作用的直接证据；3)探讨凝血酶及其受体PAR1在脑损伤后的脑康复,特别是对脑血管再生的作用。期望通过上述的研究,进一步阐明凝血酶及其受体PAR1在脑出血后的各种不同作用,为临床治疗的策略提供充分的理论和循证医学证据。第一部分凝血酶在脑出血后细胞自噬性死亡过程中的作用目的：研究凝血酶在脑出血后细胞自噬性死亡过程中的作用。方法：本实验分成两部分。第一部分为动物实验,采用立体定向脑内注射自体血的方法制作大鼠脑出血模型,干预组大鼠自体血中同时加入凝血酶抑制剂水蛭素,于制作模型后7天处死大鼠；立体定向脑内注射凝血酶制作大鼠凝血酶脑损伤模型,于制作模型后1天,3天和7天处死大鼠；用免疫组织化学染色和免疫Western Blot法检测自噬相关指标的变化,用电镜直接观察自噬细胞的存在和分布。第二部分为离体实验,大鼠原代培养星形细胞在凝血酶以及对照的生理盐水处理后,结合自噬抑制剂3-MA的应用,采取细胞免疫化学染色和免疫Western Blot法检测细胞自噬的变化,并同时应用LDH检测观察细胞总体的死亡程度。结果：第一部分的动物实验,大鼠脑出血后,注射侧基底节的自噬相关指标：LC3I向LC3-Ⅱ的转变,cathepsin D和beclin-1的表达均有明显升高,水蛭素可以抑制上述自噬相关指标的上调。在大鼠凝血酶注射模型中,术侧基底节LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变,cathepsin D和becl in-1的表达也明显升高,高峰在术后3天；电镜下可以看到凝血酶处理后3天大鼠注射侧基底节分布大量自噬细胞。第二部分离体实验中,星形细胞凝血酶处理后24小时,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变和beclin-1的表达明显升高。MDC染色进一步证实,大鼠星形细胞在凝血酶处理后自噬程度显著增加,24小时达高峰。自噬抑制剂3-MA可以抑制凝血酶激活的细胞自噬,但加重了细胞总体的死亡。第二部分PAR1在凝血酶导致脑损伤过程中的作用目的：研究PAR1在凝血酶导致脑损伤过程中所起的作用。方法：应用PAR1基因敲除(PAR1-/-)和PAR1基因部分敲除(PAR1+/-)的小鼠,和野生型(Wild type,WT)小鼠进行比较。本实验分成两部分。第一部分为动物实验,WT,PAR1+/-和PAR1-/-小鼠立体定向下脑内注射凝血酶,于制作模型后1天进行行为学评估,并分别于术后1天和3天处死,分别用Fluoro-Jade C, PANT和TUNEL染色法检测细胞死亡,用免疫Western Blot法检测脑组织内P44/42 MAPK和bc12的蛋白水平。第二部分为离体实验,WT和PAR1-/-小鼠的神经细胞经凝血酶(5或l0U/ml)处理后,提取上清液行LDH检测。结果：动物实验中,PAR1-/小鼠在行为学检查中的表现好于WT小鼠,术后3天的死亡率也低于WT和PAR1+/小鼠。PAR1-/小鼠术后1和3天注射侧基底节Fluoro-Jade C, PANT和TUNEL染色,阳性细胞数均明显少于对照WT小鼠。PAR1+/-小鼠术后1天注射侧基底节Fluoro-Jade C染色阳性细胞数也少于对照WT小鼠。免疫Western Blot法检测,PAR1-/-小鼠术后1天注射侧基底节的p-P44/42 MAPK水平明显高于WT和PAR1+/-小鼠,PAR1-/-和PAR1+/-小鼠术后3天注射侧基底节的bcl2水平显著低于WT小鼠。离体实验中,经凝血酶处理后的PAR1-/-小鼠神经细胞,上清液中LDH的含量明显低于WT小鼠神经细胞。第三部分凝血酶促进星形细胞分泌VEGF目的：研究小剂量凝血酶在脑损伤后脑康复的过程中,促进脑血管再生的作用以及相关机制。方法：本实验分成两部分：第一部分,大鼠星形细胞分别应用生理盐水,凝血酶,凝血酶受体PAR1激动剂TRAG,细胞外信号调节激酶(P44/42mitogen-activated protein kinase, P44/42 MAPK)抑制剂PD98059以及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)抑制剂YC-1处理,提取上清液行血管内皮生长因子(vascular endothel ial growth factor, VEGF)的E1ISA检测,剩余细胞行免疫化学染色,免疫Western Blot以及HIF-1α的ELISA检测。第二部分应用了WT和PAR1-/-小鼠的星形细胞,处理和检测同第一部分。结果：第一部分中,凝血酶和TRAG均可上调星型细胞中VEGF和p-P44/42 MAPK的蛋白水平,PD98059可以阻断该上调作用,YC-1则没有这种抑制作用。第二部分,PAR1-/-小鼠星形细胞中,凝血酶处理后VEGF和p-P44/42 MAPK上调的程度比较WT小鼠明显低,H工F-1α蛋白水平在经相同处理的两种小鼠星形细胞中未见明显差异。结论本实验应用动物实验和离体实验两种办法,研究凝血酶在脑出血后脑损伤和脑康复过程中的不同作用,结果表明：1.凝血酶在脑出血后细胞自噬性死亡的过程中有重要的作用。自噬在凝血酶导致的星形细胞死亡中有细胞保护的作用。2.凝血酶引起的脑损伤在PAR1-/-小鼠中程度较轻,其机制可能和P44/42MAPK通路相关。3.小剂量凝血酶上调星形细胞中VEGF的水平,该作用通过PAR1和P44/42 MAPK通路调节,但与HIF-1α的相关性不明确。凝血酶及其受体PAR1在脑出血后脑损伤和脑康复的过程中有着复杂和重要的作用。进一步的明确凝血酶在各项病理过程中的影响以及相关机制,有助于我们更加准确与合理的药物控制,抑制凝血酶的损伤作用,促进凝血酶的康复效应,以期更大程度的减轻脑损伤,促进神经康复。