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高血压疾病是最为常见的心血管疾病之一,主要以其血压持续高值的临床表征进行定义。在高血压的疾病进程中,血压的异常升高会导致血液动力学环境发生显著的变化,其中以周期性张应变的增加和切应力的局部紊乱为主要特征。同时,血管动力学研究表明,血液流动过程中所产生的力的主要承载细胞具有一定的偏向性,其中由于脉压所产生的周期性张应变主要由血管中膜层的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)所承受。相关研究表明,这种局部力学环境的变化和紊乱会直接或间接诱导血管重建。在血管重建过程中,平滑肌细胞的异常增殖扮演了重要的角色。通过实验室的前期研究发现,神经肽类物质促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)在妊娠高血压大鼠的胸主动脉血管组织中表达量显著高于野生型大鼠,该研究结果提示ACTH可能在高血压疾病进程中作为一种重要的分子参与到调控血管重建的病理过程中。本文第一部分应用细胞水平的离体周期性张应变加载实验探讨病理性周期性高张应变是否调控VSMCs内ACTH及其受体黑素皮质素受体2(Melanocortin 2 receptor,MC2R)的表达。首先,为了进一步验证病理性周期性高张应变与VSMCs异常增殖的关系,我们应用FX-5000T Strain Unit对离体培养的VSMCs分别加载5%的生理性张应变和15%的病理性高张应变;通过Brdu Elisa检测张应变加载12 h、24 h后细胞的增殖水平。同时,为了探讨ACTH及其受体MC2R是否作为力学敏感因子响应病理性周期性高张应变,我们运用放射免疫和Western blotting技术分别检测周期性张应变加载12 h、24 h后ACTH的胞内和培养液上清的蛋白水平及其受体MC2R的胞内蛋白表达水平。最后,在离体培养的VSMCs加载15%的病理性高张应变的条件下,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术下调MC2R的胞内表达水平;运用Western blotting技术检测其干扰效果;同时运用Brdu Elisa检测细胞增殖水平。分析结果显示:(1)相对于5%的生理性张应变加载组,15%的病理性高张应变加载组在周期性张应变加载12 h、24 h后细胞的增殖水平显著增加。(2)相应的,与生理组相比,病理组的ACTH的胞内蛋白水平在周期性张应变加载12 h后显著上调,上清中的蛋白水平则在24 h后显著上升。同时,受体MC2R的蛋白水平分别在周期性张应变加载12 h和24 h后显著上调。(3)在15%的病理性高张应变加载条件下,下调受体MC2R的表达水平后,细胞的增殖水平显著降低。以上结果提示,ACTH及其受体MC2R作为一种力学敏感因子响应高血压条件下的病理性周期性高张应变并调控VSMC的增殖水平。第二部分在静态条件下探讨ACTH静态刺激调控VSMC增殖的具体分子作用机制。首先,为了揭示ACTH静态刺激对VSMC增殖的调控作用,我们应用不同浓度ACTH(10 nM,100 nM,1000 nM)对静态培养的VSMCs进行刺激;运用Brdu Elisa检测细胞增殖水平。之后为了探讨ACTH调控VSMC增殖中具体作用机制,我们选用了促增殖效果最明显的ACTH(1000 nM)浓度静态刺激VSMCs;运用Western blotting技术检测不同时间点(0 min,15 min,30 min,1 h,3 h,6 h)下游细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)、信号转导子和转录激活子3(signal transduction and activators of transcription 3,STAT3)的磷酸化蛋白水平(727,705)表达变化;Brdu Elisa检测细胞增殖水平。接着,为了探讨ERK、STAT3的727位点的磷酸化上下游关系以及他们与细胞增殖的关系,我们利用不同浓度的PD98059(5μM,20μM,50μM)拮抗ERK的磷酸化,同时运用Western blotting技术检测下游p-ERK、p-STAT3(727)的蛋白水平。最后,为了探讨ERK与STAT3的磷酸化在ACTH依赖的促细胞增殖过程中的作用机制,我们通过在ACTH(1000 nM)浓度静态刺激VSMCs的条件下,利用PD98059(50μM)拮抗ERK磷酸化水平,运用Western blotting技术检测下游p-ERK、p-STAT3-727的蛋白水平表达;同时用Brdu Elisa检测细胞增殖水平。实验结果表明:(1)与空白组相比,10 nM,100 nM,1000 nM的ACTH对VSMCs的促增殖作用随着浓度的增加依次增加,其中1000 nM的ACTH的促增殖作用最为显著;(2)1000 nM的ACTH刺激VSMCs后,其下游分子ERK、STAT3的磷酸化水平分别在15 min和30 min时显著上调;(3)通过PD98059拮抗实验发现,STAT3的727位点的磷酸化依赖于ERK的磷酸化,且当PD98059的浓度为50μM时可以有效抑制ERK的磷酸化;(4)ACTH刺激VSMCs的同时运用PD98059(50μM)进行拮抗后发现,拮抗ERK的磷酸化后,可以部分消除ACTH对下游分子ERK、STAT3的727位点的促磷酸化作用,同时可以逆转ACTH的促增殖作用。综上所述,异常增高的周期性张应变可以刺激VSMCs中ACTH及其受体MC2R的表达水平上调,同时通过p-ERK、p-STAT3的信号通路调控VSMCs增殖。本研究揭示了VSMCs中ACTH及其受体MC2R对细胞增殖功能的调控作用,为高血压疾病治疗提供了新的靶点。