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恶性肿瘤是严重威胁人类健康的第二大杀手,寻找对肿瘤细胞具有高杀伤力而对正常细胞毒副作用小的新型抗肿瘤药物,具有非常重要的现实意义。本研究的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜类化合物赤霉素的代谢途径构建能够表达生产紫杉醇前体的重组赤霉菌,为20世纪人类发现的最重要的新型抗癌药物二萜类化合物紫杉醇开辟新的药源途径,为缓解药源短缺对紫杉醇应用范围进一步扩大造成的严重限制提供理论和技术依据;另一方面,为新一代抗肿瘤活性分子肿瘤血管生成抑制因子Arresten寻找安全、有效、廉价、易于推广应用的蛋白表达生产系统。 Ⅰ 采用RT-PCR方法从红豆杉胚性愈伤组织细胞系E3B中克隆紫杉二烯合成酶基因全长cDNA。将可以在大肠杆菌BL21s中表达、序列正确的紫杉二烯合成酶基因全长cDNA引入表达载体pAN52-1Not的起始密码子ATG下游,并将选择标记潮霉素B抗性表达框引入pAN52-1Not完整转录单位的侧翼区域,获得紫杉二烯合成酶基因cDNA表达载体pANts-hyg。 Ⅱ 采用PCR扩增法从赤霉菌基因组中克隆了赤霉素生物合成途径中第一个特异性关键酶——内根-贝壳杉烯合成酶基因cps的部分序列作为同源片断,以平端连接的方式引入丝状真菌表达载体pCSN44的HindⅢ位点,获得旨在中断赤霉素生物合成途径的cps基因打靶载体pCSNcps。 Ⅲ 通过单因素实验建立了本实验用赤霉菌菌株原生质体制备方法。研究结果表明,以10ml含15%粗制崩溃酶的酶解体系于37℃酶解4h,6个实验用赤霉菌受试菌株的原生质体产量都可以达到10~6/mL,能够满足遗传转化操作的需要,而使用溶壁酶制备实验用赤霉菌菌株原生质体的产量不足10~3/mL。 Ⅳ 建立了适用于赤霉菌菌株CBS195.34的原生质体/PEG法转化体系,通过原生质体/PEG转化法获得少量赤霉菌转化子。经过PCR检测及Southern blot杂交检测,证实本研究采用原生质体/PEG法以pANts-hyg转化获得一株基因组整合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌转化子和4株pCSNcps转化、潮霉素B抗性水平高于亲本菌株的赤霉菌转化子。整合有外源基因的赤霉菌转化子的生长形态和生长能力与亲本菌株相比存在显著差异。而且,随着传代次数的增加,