【摘 要】
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糖尿病足是一种由高血糖引起伤口部位炎症失调的糖尿病并发症,也是医学上至今尚未解决的难题,故设计开发一类具有免疫调节活性、对慢性炎症产生帮助的敷料是有效的可行方案之一。卡拉胶是一类从海洋红藻中提取出来的硫酸线性多糖,其因硫酸酯基含量的不同及结构上的差异能够产生不同的免疫调控活性。本研究将商品级的κ-卡拉胶进行脱硫,制备出不同硫酸酯基含量的κ/β-卡拉胶寡糖,通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、一维及二
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糖尿病足是一种由高血糖引起伤口部位炎症失调的糖尿病并发症,也是医学上至今尚未解决的难题,故设计开发一类具有免疫调节活性、对慢性炎症产生帮助的敷料是有效的可行方案之一。卡拉胶是一类从海洋红藻中提取出来的硫酸线性多糖,其因硫酸酯基含量的不同及结构上的差异能够产生不同的免疫调控活性。本研究将商品级的κ-卡拉胶进行脱硫,制备出不同硫酸酯基含量的κ/β-卡拉胶寡糖,通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、一维及二维核磁共振(NMR)、元素分析(EA)及凝胶渗透色谱分析(GPC)等方法测定了降解前后卡拉胶的结构、硫酸酯基含量及分子量大小;通过细胞增殖实验(CCK-8)检测了κ/β-卡拉胶寡糖对RAW264.7巨噬细胞和NIH-3T3成纤维细胞的增殖毒性;采用激光共聚焦显微镜观察罗丹明-鬼笔环肽染色后细胞的形态;用实时定量基因扩增荧光检测(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和流式细胞术(FCM)检测了κ/β-卡拉胶对M1期RAW264.7巨噬细胞相关免疫因子的分泌的影响及M1期与M2期巨噬细胞的比例分布变化;并利用Transwell培养系统和细胞划痕模拟实验测定了其通过刺激巨噬细胞间接对成纤维细胞增殖的调控及胶原分泌的影响。最后将材料与胶原共混冻干制成孔洞均匀且孔径合适的海绵支架,并建立糖尿病大鼠全皮层缺损实验,用大体观察、H&E染色和Masson染色的方法分析材料对创伤的修复效果。结果表明,κ-卡拉胶成功脱硫并降解得到低硫酸酯基含量和低分子量的κ/β-卡拉胶,脱硫过程伴随部分甲基化反应;在细胞增殖毒性测试中发现高浓度(400μg/m L)材料对RAW264.7及NIH-3T3细胞均无明显的毒性,且具有良好的生物相容性。低硫酸酯基含量的κ/β-卡拉胶寡糖(L-DS-KOS)能刺激M1型RAW264.7巨噬细胞大量分泌抑炎因子白介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β2同时减少促炎因子IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的分泌。而FCM的结果显示,L-DS-KOS可以有效的加速M1型RAW264.7巨噬细胞向M2表型转化,进而产生抗炎作用。Transwell共培养的结果显示L-DS-KOS可以通过调控M1期巨噬细胞来加快下层成纤维细胞的生长速率,同时提升Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达量,模拟划痕实验中更快的划痕愈合率也证实了其更对成纤维细胞增长的加速作用。糖尿病大鼠全皮层缺损修复的大致观察显示,L-DS-KOS/胶原比例3:7的海绵敷料能够有效的加速伤口的愈合,通过H&E和Masson染色观察可以看到其能更好地缩短创伤部位的炎症期,并改善胶原沉积和上皮形成的过程,从而促进糖尿病大鼠皮肤创伤修复。考虑到其能有效调控免疫因子的分泌并加速巨噬细胞表型从M1向M2的转化进而改善糖尿病创伤部位特殊的长期炎症微环境,我们认为其有望作为一种新型的免疫调控活性材料用于糖尿病创面敷料的设计。
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