妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠期间母体由于胰岛素分泌或者应答异常而造成的不同程度葡萄糖代谢异常。近年来,在中国妊娠期糖尿病发病率逐渐升高,已成为影响妊娠妇女的严重的代谢性疾病,临床上常表现为妊娠期间严重的糖代谢异常。现今对妊娠期糖尿病的治疗手段仍然以传统的治疗方式为主,即饮食指导、运动治疗、胰岛素治疗。然而,受患者依从性及教育程度不同的影响,传统治疗方式对妊娠期糖尿病的控制并不理想。而胰内胚层干细胞移植作为一种新兴的治疗方式,其治疗方法及其疗效越来越受到临床的重视。干细胞治疗相比于胰岛移植具有不受供体不足的限制、可长期供应胰岛β细胞以及减少免疫抑制剂使用等优点,其中人胚胎干细胞由于其全能性较高、分化能力强的优点,具有极大治疗妊娠期糖尿病的潜力。由于妊娠期的特殊性和伦理限制,很多有创研究无法开展,而动物模型是一种较好的研究媒介。本研究根据以往文献构建妊娠期糖尿病小鼠模型,通过Kroon E的四部分离法从人胚胎干细胞定向诱导分化出胰腺胚胎干细胞（hESC-PE）,移植于小鼠体内,检测移植hESC-PE后对妊娠期糖尿病小鼠的治疗效果,疗效分析内容包括检测随机血糖、胰岛素水平、体重等糖尿病常用的监测指标。文献表明,妊娠期糖尿病患者表现出较多的胚胎停育并且在动物实验中妊娠期糖尿病小鼠产生胎儿的数目明显降低,同时在db/+妊娠期糖尿病模型的小鼠中,胎儿的体重增高了5-8%,本研究对其胎鼠体重、胎鼠活胎存活率、2周后胎鼠死亡率也进行观察统计。此外,前期实验还发现,治疗所需要移植的hESC-PE细胞数量较大,而这一现象推测可能与移植手术时容易产生氧化应激反应有关,从而导致疗效的降低。本研究利用柚皮素的的抗氧化作用,提高干细胞应用效率,观察胰内胚层干细胞移植妊娠期糖尿病小鼠联合应用柚皮素缓解妊娠期糖尿病的症状的疗效。第一部分:小鼠妊娠期糖尿病模型的建立和验证目的:建立妊娠期糖尿病GDM小鼠模型,并验证建模是否成功,为后续实验奠定研究平台。方法:1实验选用6-8周龄C57BL/KsJ^+/+（野生型,WT）雌性小鼠20只,雄性WT小鼠10只、6-8周龄C57BL/KsJ-Lep^db/+（杂合子,db/+）雌性小鼠20只,雄性db/+小鼠10只。db/+小鼠是由于瘦素受体（Ob R）突变,无法抑制进食行为,在妊娠的过程中,db/+雌性小鼠会表现出食欲过盛的进食行为,肥胖程度增加,进一步导致胰岛素抵抗的发生并出现妊娠期糖尿病症状,表现为轻微的葡萄糖耐受不良,因此,是模拟人类妊娠期糖尿病的最佳小鼠模型。给予小鼠自由饮用灭菌水以及自由进食正常普通饲料（Chow Diet,CD）。13周龄时交配,选取db/+健康雄鼠与db/+雌鼠按1:2比例进行配种,合笼时间为下午五点左右,次日清晨检测雌鼠是否有阴道栓,若有阴道栓记为妊娠第0天（GD0）,配种时间控制在第13周内。同时,野生型WT雌性以及雄性WT小鼠也按上述方法进行交配,作为对照组。2在妊娠期间给予足够一定质量的饲料,让小鼠自由进食,每隔24小时分别记录WT组和db/+组妊娠小鼠的进食量。并在妊娠期第16天（GD16）用天平测定各组妊娠小鼠的体重。在GD 20时,将母鼠异氟烷麻醉后打开腹腔,从子宫中取出胎鼠,称量并记录各组胎鼠重量及胎盘重量。3通过外观行为学观察、GD10及GD18未禁食随机血糖水平测定、外周血胰岛素水平测定,鉴定GDM小鼠模型是否造模成功。4进一步通过糖耐量以及胰岛素激发实验的检测对GDM小鼠模型的糖代谢功能异常进行进一步验证是否造模成功。糖耐量实验具体方法为:两组小鼠先饥饿6小时,然后给予腹腔注射2g/kg体重的葡萄糖,并于注射后0 min、30 min、60 min通过剪尾采取小鼠尾静脉外周血,并立即用罗氏便携式血糖仪测定两组血糖水平。胰岛素激发实验具体方法为:两组小鼠先饥饿6小时,然后给予腹腔注射0.75 U/kg体重的胰岛素,并于注射后0 min、30 min、60 min采集小鼠尾静脉外周血,并立即用罗氏便携式血糖仪测定测定WT和db/+这两组母鼠外周血葡糖糖水平,结果以占胰岛素注射前血糖水平的百分比形式显示（初始值%）。结果:1由于不是所有雌性小鼠在交配后都能够妊娠,最终入组15只WT妊娠小鼠以及12只妊娠db/+小鼠进行实验。2在妊娠前,WT小鼠以及db/+小鼠的能量摄入并没有明显的差异（3.82±0.09克/天、3.98±0.11克/天;P>0.05）,然而妊娠以后,相较于WT小鼠在妊娠期GD0-5、GD6-11、GD12-16的能量摄入量（3.76±0.07克/天、4.01±0.06克/天、4.82±0.08克/天）,db/+小鼠均明显上升（4.08±0.09克/天、4.67±0.08克/天、5.93±0.09克/天;P<0.05）。在妊娠之后,相较于WT妊娠小鼠来说,db/+母鼠的体重明显增加（40.51±0.66vs 28.73±0.56克;P<0.05）。在妊娠期第20天（GD20）,通过剖腹产获得胎鼠。与人类GDM相似,db/+母鼠的后代体重相比WT母鼠后代的体重明显增加（1.61±0.05 vs 1.39±0.06克;P<0.05）,而胎盘重量没有明显差异。3通过观察小鼠外观行为变化发现,多数db/+妊娠小鼠表现出多饮、多尿、多食、搔痒、毛发失去光泽,部分动物出现“炸毛现象”、活动减少等现象。并且未禁食随机血糖测定结果显示,在妊娠前WT和db/+两组小鼠血糖水平几乎相似（161.8±2.3 vs165.7±4.7mg/dl,P>0.05）,而妊娠之后,WT组孕鼠血糖仍维持稳定,而db/+妊娠小鼠的血糖水平却呈现出明显的上升,GD10随机血糖205.5±5.2 mg/dl,GD18随机血糖215.7±4.3mg/dl,符合Korec等报道的C57BL/Ks J-Lep^db/+小鼠妊娠期糖尿病的造模成功标准,以未禁食随机血糖大于200mg/ml并稳定一周为造模成功。在妊娠前WT和db/+两组小鼠未禁食随机外周血胰岛素水平几乎相似（0.71±0.05 vs 0.72±0.07ug/L;P>0.05）,但在妊娠之后,WT组妊娠小鼠外周血胰岛素水平仍维持稳定,而db/+妊娠小鼠的外周血胰岛素水平却呈现出明显的上升,GD18胰岛素水平（0.75±0.03 vs 1.46±0.08ug/L;P<0.05）,表现出类似妊娠期糖尿病典型的高胰岛素血症。4在妊娠前,db/+小鼠糖耐量实验外周血葡萄糖水平在0分钟、30分钟、60分钟与WT组小鼠相比并没有明显差异。而在GD17,再分别对WT和db/+两组妊娠小鼠进行糖耐量实验。结果显示,db/+妊娠小鼠与WT妊娠小鼠0分钟空腹血糖无统计学差异（127.8±5.3 vs120.7±4.6mg/dl,P>0.05）,30分钟两组血糖明显上升,db/+妊娠小鼠上升幅度更大（313.5±6.2 vs 202.2±8.1mg/dl,P<0.05）,60分钟db/+妊娠小鼠血糖仍高于WT妊娠小鼠（248.9±5.2 vs 167.7±5.3mg/dl,P<0.05）。在GD19时,我们在WT和db/+两组妊娠小鼠中进行了胰岛素激发实验。30分钟及60分钟db/+妊娠小鼠外周血葡萄糖水平分别下降5%和25%,而WT妊娠小鼠的外周血葡萄糖水平分别下降49%和56%,db/+小鼠表现出明显胰岛素抵抗。结论:本部分实验应用C57BL/KsJ-Lepdb/+（db/+）突变株小鼠,该小鼠在妊娠期表现出典型的妊娠期糖尿病症状,并对该小鼠模型的葡萄糖代谢功能进行进一步验证,表明妊娠期糖尿病GDM小鼠模型建立成功,将为后续实验的顺利开展奠定基础。第二部分:人胚胎干细胞源性胰内胚层细胞（hESC-PE）对db/+小鼠妊娠期糖尿病的疗效目的:探讨h ESC-PE治疗db/+妊娠小鼠妊娠期糖尿病的疗效方法:利用Kroon E的四步分离法诱导分化得到hESC-PE,将5×10⁶个hESC-PE移植于8周龄db/+小鼠的左肾被膜下,13周龄时交配,若有阴道栓记为妊娠第0天（GD0）,配种时间控制在第13周内。并设置了三组,分别为野生型妊娠雌鼠组（WT组）,db/+型妊娠雌鼠组（db/+组）,hESC-PE移植db/+妊娠雌鼠组（db/+PE组）,每组各15只。选取移植前一天作为第0天,分别检测了各组小鼠移植前第0天（Day0）,妊娠第0天（GD0）,妊娠第10天（GD10）,妊娠第20天（GD20）的随机血糖含量、随机血浆胰岛素含量以及体重。本实验在GD 20时,将母鼠异氟烷麻醉后打开腹腔,从子宫中取出胎鼠,称量并记录各组胎鼠数目及重量。妊娠终止后处死孕鼠,肾包膜下移植细胞切片HE染色,观察移植细胞状况。结果:1对获得的h ESC-PE进行分析,实时定量PCR及免疫荧光染色结果表明细胞中OCT4表达消失,而PDX1、FOXA2和SOX9高表达,符合为hESC-PE的表达规律。2三组实验鼠妊娠前随机血糖基本一致（152.1±2.6,163±1.8,157.2±1.4mg/dl;P>0.05）。妊娠开始之后对照组（WT组）的随机血糖变化较妊娠之前无明显变化。而db/+组妊娠小鼠随机血糖水平表现为妊娠期糖尿病特征性的高血糖现象,GD20随机血糖210.6±8.5mg/dl,与WT组GD20随机血糖160.5±1.8mg/dl比较有统计学意义（P<0.05）。db/+PE组则与WT组一样与妊娠前相比保持比较稳定状态,GD20随机血糖162.4±5.0pg/dl,与WT组GD20随机血糖相比无统计学差异（P>0.05）。这表明hESC-PE移植可以显著缓解GDM小鼠的血糖升高。3三组实验鼠血液中的随机血浆胰岛素水平在妊娠前并未有明显的差异（0.78±0.02,0.75±0.05,0.81±0.01ug/L;P>0.05）。WT组妊娠前后胰岛素无明显变化（0.74±0.04 vs 0.78±0.01ug/L;P>0.05）。在妊娠之后db/+组GD20随机血浆胰岛素水平明显上升,与WT组比较有统计学差异（1.49±0.03 vs 0.74±0.04ug/L;P<0.05）。而db/+PE组妊娠后胰岛素比较稳定,GD20随机血浆胰岛素水平与WT组无统计学差异（0.81±0.08 vs0.74±0.04ug/L;P>0.05）。这表明hESC-PE移植能够缓解妊娠期间血液中高胰岛素的产生。4三组实验鼠体重妊娠前无明显差异（P>0.05）,WT组妊娠前体重16.6±0.12g,GD20体重升至28.3±1.24g。db/+组GD20体重38.3±1.10g,与WT组GD20体重比较有统计学意义（P<0.05）。db/+PE组GD20体重29.0±1.38g,与WT组GD20体重比较无统计学意义（P>0.05）。这表明hESC-PE移植能够有效的抑制GDM造成的体重异常增高。5 WT组雌鼠共分娩了110只胎鼠,db/+PE组雌鼠分娩了106只,而db/+组雌鼠分娩了80只,与其他两组比较有统计学意义（P<0.05）。这表明hESC-PE移植能够提高妊娠期糖尿病小鼠的胚胎存活率。6测量胎鼠的体重,db/+组胎鼠的体重（1.61±0.03 g）明显高于WT组胎鼠体重1.41±0.02 g（P<0.05）,然而db/+PE组胎鼠体重1.39±0.02g与WT组胎鼠体重接近,这表明胰内胚层细胞移植能够缓解GDM雌鼠的胎鼠体重的异常增高。7各组胎鼠两周内的生存率进行统计,结果发现db/+组胎鼠的死亡率明显高于WT组（45%vs 25%;P<0.05）,同时db/+PE组胎鼠死亡率25%,与WT组近似,这表明hESC-PE移植能够提高GDM胎鼠的生存率。8肾包膜下移植切片HE染色,移植分化细胞聚集于肾包膜下,HE染色呈现大块移植物,其周围淋巴细胞浸润较少,以移植物与肾实质交界处最明显,数量较多,形态像胰腺组织中的胰岛细胞团,界限清楚,细胞形态不一,可见到比较丰富的细胞外基质,血管已经生成。结论:1应用Kroon E的四步分离法能够成功分化得到hESC-PE。2移植h ESC-PE能够有效地缓解妊娠期糖尿病症状,且控制其糖代谢维持正常水平,降低了GDM小鼠血糖、胰岛素及体重。3移植hESC-PE能够改善GDM雌鼠的胚胎存活率,能缓解GDM雌鼠胎鼠体重的异常增高,能够提高GDM胎鼠的生存能力。第三部分:柚皮素可提高hESC-PE对小鼠妊娠期糖尿病的疗效目的:探讨柚皮素抗氧化作用在hESC-PE对小鼠GDM的疗效的影响方法:1体外实验中,使用不同浓度柚皮素（Naringenin,NGN）对hESC-PE进行处理,在高氧的环境下（加H₂O₂）,用MTT方法检测不同柚皮素浓度下hESC-PE的存活情况。2利用DCFH-DA染色检测细胞内相关ROS产物,进而分析柚皮素对细胞的抗氧化作用。3为验证柚皮素是否可增强h ESC-PE的疗效,本部分动物实验在移植前一天实验小鼠腹腔注射柚皮素50mg/kg,并在第二部分实验基础上,减少hESC-PE移植数目,将诱导分化出来的3×10⁶个hESC-PE移植于8周龄db/+小鼠的左肾被膜下,13周龄时交配,若有阴道栓记为妊娠第0天（GD0）,配种时间控制在第13周内。并设置了四组,分别为妊娠的野生型雌鼠组（WT组）,单用柚皮素治疗妊娠的db/+小鼠组（db/+NGN组）,h ESC-PE移植db/+雌鼠组（db/+PE组）,hESC-PE移植到妊娠的db/+雌鼠组,同时加用柚皮素组（db/+PE+NGN）每组各12只。选取移植前一天作为第0天,分别检测了各组小鼠移植前第0天（Day0）,妊娠第0天（GD0）,妊娠第10天（GD10）,妊娠第20天（GD20）的未禁食随机血糖、血浆胰岛素、孕鼠体重及胎鼠活胎分娩率、2周后存活数等指标。结果:1相较于空白对照组,H₂O₂组细胞内产生的活性氧簇（ROS）产物较多,平均高出37.9±8.3%。而相较于空白对照组,H₂O₂+柚皮素组降低细胞内产生的ROS,平均升幅为19.1±7.5%,其中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛等抗氧化应激分子并未降低,提示柚皮素可以降低细胞内ROS产物的数量并保护了细胞内的多种抗氧化系统。2在妊娠的WT组中,妊娠小鼠随机血糖浓度维持稳定（143.5±9.6vs 137.5±8.34mg/dL;P>0.05）。而db/+NGN组的妊娠小鼠随机血糖无改善207.6±7.9mg/dL,与WT组血糖143.5±9.6mg/dL比较,有统计学意义（P<0.01）。db/+PE+NGN组妊娠小鼠随机血糖151.2±8.07mg/dL与WT组的随机血糖143.5±9.6mg/dL比较无统计学意义（P>0.05）,低于db/+PE组妊娠小鼠随机血糖182.4±7.6 mg/dL（P<0.05）。这提示柚皮素与hESC-PE移植联合应用后,更好控制妊娠小鼠血糖浓度。3单用柚皮素组妊娠小鼠体重明显高于WT组（32.12±0.93 vs 25.91±0.89g;P<0.01）。db/+PE+NGN组妊娠小鼠体重26.14±0.82g与WT组25.91±0.89g相近（P>0.05）,低于db/+PE体重28.91±0.84g,有统计学差异（P<0.05）。这提示柚皮素与hESC-PE移植联合应用后,更好控制孕鼠体重。4单用柚皮素组妊娠小鼠随机血清胰岛素水平0.604±0.037ug/L,低于WT组妊娠小鼠胰岛素水平0.793±0.036ug/L（P<0.01）。db/+PE+NGN组妊娠小鼠胰岛素水平0.803±0.041ug/L,与WT组比较无差异（P>0.05）,高于db/+PE组妊娠小鼠随机血清胰岛素水平0.697±0.04ug/L（P<0.05）。这提示柚皮素与hESC-PE移植联合应用后,可改善胰岛素水平。5测量胎鼠的体重,单用NGN组胎鼠的体重（1.48±0.03 g）明显高于WT组胎鼠体重1.30±0.02 g（P<0.05）,然而db/+PE+NGN组胎鼠体重1.31±0.02g与wt组胎鼠接近（P>0.05）,低于单hESC-PE组胎鼠体重1.36±0.02g（P<0.05）。这表明柚皮素与胰内胚层细胞移植联合应用能够缓解妊娠期糖尿病雌鼠的胎鼠体重的异常增高。结论:1体外实验表明柚皮素能够提高氧化应激环境中hESC-PE的活力,并降低细胞内的氧化应激反应,保持抗氧化分子的活力。2体外实验表明柚皮素可以降低细胞内ROS产物的数量并保护了细胞内的多种抗氧化系统。H₂O₂+柚皮素组降低细胞内产生的ROS;超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛等抗氧化应激分子得到保护。3在第二部分实验基础上,本部分研究减少hESC-PE移植数量将近一半,实验结果表明,hESC-PE移植联合应用柚皮素组较单hESC-PE移植组可进一步缓解妊娠期糖尿病高血糖、高胰岛素血症、高体重等现象,同时,提高了胎鼠活胎分娩率及2周后胎鼠生存率。虽然移植hESC-PE数目减少将近一半,但是联合柚皮素,GDM控制达到标准量干细胞移植的效果,说明柚皮素提高hESC-PE移植治疗GDM小鼠效率。