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目的: (1)建立人乳腺癌细胞MCF-7的体外失巢模型,利用差异蛋白质组学方法研究失巢培养与贴壁培养的MCF-7细胞的蛋白表达变化,了解失巢凋亡在肿瘤细胞转移过程中的分子机制。 (2)探讨“嵌入式死亡”在MCF-7细胞失巢过程中的作用及其相关分子信号。 方法: (1)采用阴离子聚合物Poly-HEMA(多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂)包被的六孔板对MCF-7细胞进行多轮悬浮培养,利用流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜,采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法观察非失巢组和失巢组的细胞凋亡率以及细胞形态变化,确定失巢培养“驯化”终点,获得具有高抗失巢凋亡特性的MCF-7细胞作为后期实验细胞。收获失巢终点的MCF-7细胞及正常贴壁MCF-7细胞,并提取总蛋白,进行双向凝胶电泳(2-DE)与基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)检测,鉴定表达差异的蛋白质点并选取部分进行免疫印迹验证,并以高转移特性的肿瘤细胞作为阳性对照。 (2)失巢驯化MCF-7细胞,收集每轮次培养6h的细胞并采用CellTracker细胞示踪染料进行标记,激光共聚焦显微镜检测细胞内化率。选择细胞内化率最高的第一轮失巢培养MCF-7细胞分为非内化组(失巢培养0h)和内化组(失巢培养6h),收获细胞并提取总蛋白进行2-DE分离与MALDI-TOF/TOF-MS质谱检测,鉴定表达差异的蛋白质点并选取部分进行免疫印迹验证。 结果: (1)经过失巢驯化后MCF-7细胞抱团生长,第一轮至第四轮失巢培养的MCF-7细胞凋亡率分别为40.62±5.35%,23.94±7.78%,17.78±3.92%,15.70±3.82%。前三轮细胞凋亡率逐渐降低。第四轮与第三轮的细胞凋亡率差异无统计学意义,确定第三轮为失巢驯化终点。差异蛋白质组学分析鉴定出8个差异表达蛋白质点,在细胞中分别参与蛋白折叠、细胞周期与增殖、糖酵解等过程,选取ω-酰胺酶NIT2(Omega-amidase NIT2),埃兹蛋白(Ezrin),人类表皮生长因子受体2(HER-2)进行免疫印迹验证,与质谱结果吻合。 (2)细胞示踪染色法检测MCF-7细胞经过第一至第三轮失巢培养6h后细胞内化率分别为32.50±9.60%、24.40±8.60%和14.70±6.90%,内化率随着失巢轮数的增加而逐渐下降。分别提取内化组与非内化组率细胞总蛋白进行2-DE分离和MALDI-TOF/TOF-MS质谱鉴定,鉴定出18个差异表达蛋白质点,在细胞中分别参与蛋白酶解、细胞周期与增殖、氧化还原等过程。选取组织蛋白酶-D(CTSD),局部粘着斑激酶(FAK),上皮细胞粘连蛋白(E-cadherin),Rho样小GTP酶(Rac1)进行免疫印迹验证,与质谱结果吻合。 结论: (1)成功建立人乳腺癌MCF-7细胞体外失巢模型,经过驯化后的肿瘤细胞抗失巢凋亡能力提高,NIT2,Ezrin,HER-2在失巢培养与正常贴壁培养过程中的表达有差异,可作为进一步探讨乳腺癌恶化或转移的靶向蛋白标志物。 (2)肿瘤对“嵌入式死亡”的抵抗能力增强可能是肿瘤恶化或转移发生的机制之一。CTSD,FAK,E-cadherin,Rac1的表达变化可能对嵌入式死亡(Entosis)的发生起到重要作用。