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马铃薯卷叶病毒属病毒(poleroviruses)属于黄症病毒科(Luteoviridae),具有韧皮部局限特性,有关其系统运动及韧皮部局限机制的研究一直都是热点及难点。已有的研究表明,通读蛋白(readthrough protein,RTP)与病毒的系统运动、症状表达及韧皮部局限相关,但是其具体作用机制尚不清楚;RTP的通读区域(readthrough domain,RTD)位于病毒粒子表面,可能通过与其他蛋白互作来协助病毒的运动等过程,然而有关其互作蛋白的报道很少。侵染十字花科作物的芸薹黄化病毒(Brassica yellows virus,BrYV)是本实验室发现的该属一种新病毒,根据其5’端序列差异可分为A、B、C三种基因型。本论文以BrYV为研究材料,构建了两种基因型(A型与B型)的侵染性克隆,对新病毒的生物学特性进行研究;筛选与RTD互作的植物蛋白,对这种互作与BrYV系统侵染之间的关系进行初步探索。BrYV-A与BrYV-B全长cDNA克隆都能通过农杆菌浸润接种的方法系统侵染本生烟,在接种叶引起明显坏死,而上部叶片没有明显症状。A型与B型的序列差异主要位于基因组5’端,因此将二者5’端序列互换构建了人工重组全长cDNA克隆,比较其在本生烟上的症状及侵染力与野生型病毒是否有差别。结果发现这种序列互换并不影响病毒在本生烟上的症状及系统侵染力。以RTD为诱饵蛋白,利用酵母双杂交的方法筛选拟南芥cDNA文库,获得互作蛋白S-腺苷甲硫氨酸合成酶4(S-adenosylmethionine synthetase 4,SAMS4)。在本生烟中,全长AtSAMS4定位于细胞质及细胞核,RTD定位于细胞核;BiFC验证了二者能够在本生烟的细胞核而非核仁中互作。首次克隆获得了本生烟同源蛋白NbSAMS mRNA全长序列,并验证了 BrYV的系统侵染会使NbSAMS mRNA表达水平降低约50%,该结果意味着BrYV侵染可能与SAMS的表达密切相关。BrYV侵染性克隆的成功构建和对RTD互作蛋白的筛选及互作验证,为深入研究病毒系统运动机制、病毒-寄上互作提供了有用工具及新的研究思路。在植物及无脊椎动物中,RNA沉默(RNA silencing)作为最主要的抗病毒机制已被广泛接受。病毒siRNA(viral siRNA,vsiRNA)的产生是这种防御反应重要的分子标志及关键因子。典型的vsiRNA由Dicer切割双链RNA产生,正负链比例为1,能够被AGO复合体富集。在动物中,RNA沉默又称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。尽管哺乳动物具有保守的RNAi通路,但在被病毒感染的个体或细胞系中尚未能检测到具有典型特征的vsiRNA,有关RNAi是否具有抗病毒功能的争论一直都没有统一的结论。野田村病毒(Nodamura virus,NoV)属于野田村病毒科(Nodaviridae)、a野田村病毒属(Alpanodavirus)。已知野生型NoV感染小鼠乳鼠致死;而不表达其抑制子蛋内B2的突变体病毒NoVΔB2感染小鼠不致死,产生大量长度主要为22 nt且具有Dicer切割产物特征的siRNA。在此基础上,本论文利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)结合小RNA文库分析的方法对NoVΔB2感染小鼠乳鼠产生的siRNA特征做进一步分析。AGO-IP得到NoVΔB2来源的小RNA除具有Dicer切割产物的特征、正负链比例接近1以外,5’端第一个碱基还具有U(1U)偏好,并且相比未经AGO-IP的样品而言,具有这种特征的小RNA比例增高,说明NoVAB2感染小鼠乳鼠产生了典型的vsiRNA。在NoV感染的小鼠乳鼠中,与AGO结合的病毒小RNA虽然也具有上述特征,但是丰度非常低;而在B2-IP得到的小RNA中,检测到大量具有Dicer切割产物特征、正负链比例接近1的siRNA,但是没有1U特征,意味着B2可能与AGO竞争结合这些siRNA。用同样的方法检测甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染人源293T细胞系产生的小RNA。不表达抑制子蛋白NS1的突变体病毒IAVdelNS1产生了大量的小RNA,但是仅在AGO-IP样品中检测到具有典型vsiRNA特征的小RNA;在被野生型IAV感染的细胞中,不论是否经过AGO-IP,都不能检测到经典的vsiRNA。本论文证实了哺乳动物病毒产生的siRNA除了具有已报道的Dicer切割产物特征,还能够被AGO复合体富集,由此建立了一种用不表达抑制子蛋白的突变体病毒结合AGO-IP高通量测序检测哺乳动物病毒siRNA的新实验体系,为深入研究哺乳动物抗病毒RNAi反应机制打下了基础。