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第一部分:DFNA5表达分布及亚细胞定位的研究目的:通过新生大鼠全身多个器官DFNA5表达量检测、大鼠耳蜗冰冻切片和HEI-OC1细胞免疫荧光染色,研究DFNA5在大鼠体内的表达分布及亚细胞定位。方法:取新生1天SD大鼠的肝、肺、肾、脾、心脏、肌肉、脑和耳蜗等组织器官,提取总蛋白质,通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测DFNA5在各组织器官中的表达水平;取新生1天SD大鼠耳蜗进行冰冻切片,免疫荧光染色观察DFNA5在耳蜗内的表达分布;免疫荧光染色观察DFNA5在HEI-OC1细胞中的亚细胞定位。结果:大鼠耳蜗、肌肉、脑、脾、心脏、肾、肺和肝等组织器官中均表达DFNA5,其中耳蜗表达量最高;冰冻切片结果显示DFNA5在大鼠耳蜗中内源性表达于毛细胞和螺旋神经节细胞中;传代培养的HEI-OC1细胞内源性表达的DFNA5均匀分布于胞质中。结论:大鼠多个组织器官内源性表达DFNA5,耳蜗中表达水平最高,耳蜗内DFNA5主要表达于毛细胞和螺旋神经节细胞中,HEI-OC1细胞内源性表达的DFNA5主要分布于胞质。第二部分:不同DFNA5片段对哺乳动物细胞毒性作用的研究目的:通过将不同DFNA5片段转染HEK-293T细胞和HEI-OC1细胞,观察其引起的细胞形态学改变和毒性作用,探讨DFNA5截短突变致细胞毒性的相关机制。方法:构建DFNA5全长(DFNA5-FL)、氨基端片段(DFNA5-NT)、羧基端片段(DFNA5-CT)和第8外显子跳跃缺失片段(DFNA5-Δexon8)等表达载体,将鉴定正确的重组表达载体转染HEK-293T细胞和HEI-OC1细胞,转染后36h在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态变化,检测转染后细胞培养基上清LDH浓度,计算死亡细胞百分比。结果:(1)在HEK-293T细胞中转染DFNA5片段氨基端带有EGFP标签的重组质粒36h后,NT和Δexon8两组细胞形态明显异常,表现为胞体轻度皱缩,胞膜表面不光滑,胞内荧光分布不均匀等,但各组死亡细胞百分比之间差异甚微,尽管在统计学上存在意义(P<0.05);转染DFNA5片段羧基端带有Myc标签的重组质粒36h后,NT组和Δexon8组死亡细胞百分比明显升高,与阴性对照组、FL组或CT组比较差异均具有统计学意义(P<0.05);转染DFNA5片段氨基端带有Flag标签的重组质粒36h后,NT组死亡细胞百分比明显升高,Δexon8组死亡细胞百分比轻度升高,二者与阴性对照组、FL组或CT组比较差异均具有统计学意义;(2)在HEI-OC1细胞中转染DFNA5片段羧基端带有Myc标签的重组质粒48h后,各组死亡细胞百分比之间无显著差异。结论:通过构建携带不同DFNA5片段的重组质粒转染哺乳动物细胞,证实了DFNA5-NT和DFNA5-Δexon8可以引起细胞形态异常和死亡增加,且初步证明这种细胞死亡方式是焦亡;突变型DFNA5引起的细胞毒性来自于DFNA5的氨基端片段,而与移码突变错误翻译出的41个异常氨基酸无关,DFNA5的氨基端结构对于截短型DFNA5的致焦亡功能至关重要,氨基端蛋白修饰在一定程度上将影响其功能的发挥;DFNA5-FL或DFNA5-CT不能引起细胞焦亡。第三部分:DFNA5截短突变对小鼠内耳作用的研究目的:通过小鼠耳蜗圆窗膜显微注射携带人类DFNA5第8外显子跳跃突变基因(DFNA5-Δexon8)的重组腺相关病毒载体,使其转染小鼠内耳并表达,进一步探究DFNA5突变致聋的相关机制。方法:将36只野生型C57BL/6J小鼠随机分为四组,实验组12只,GFP过表达组12只,人工外淋巴液组6只,均以左耳为手术耳,分别经耳后径路通过圆窗膜向鼓阶内注射2μL r AAV2/9-DFNA5-Δexon8-GFP、r AAV2/9-GFP和人工外淋巴液;空白对照组6只,正常饲养,不做任何处理。于术后21d对所有动物进行ABR测试评估听力,之后取耳蜗基底膜免疫荧光染色铺片,激光共聚焦显微镜观察。结果:(1)术后21d听力测试结果显示:实验组、GFP过表达组及人工外淋巴液组动物左耳ABR各频率反应阈均不同程度升高,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);实验组、GFP过表达组与人工外淋巴液组动物左耳ABR各频率反应阈之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05);各组动物右耳ABR各频率反应阈比较差异均无统计学意义(P>0.05);(2)GFP过表达组动物耳蜗基底膜底回、中回、顶回的内毛细胞中均有绿色荧光表达,转染阳性细胞呈逐渐减少的趋势,底回、中回及顶回的内毛细胞平均转染效率分别为82.7%、75.0%、44.7%,转染阳性细胞排列整齐,形态正常,未见肿胀、萎缩或脱落等细胞毒性表现,外毛细胞中未见绿色荧光表达;(3)实验组动物耳蜗基底膜上的转染阳性细胞主要为内毛细胞,胞内绿色荧光分布不均匀,呈大小不一的颗粒样,主要位于胞质,极个别外毛细胞也有绿色荧光表达,转染阳性细胞整体排列整齐、形态正常,未见肿胀、皱缩或脱落等细胞毒性表现。结论:携带目的基因的重组腺相关病毒载体可通过经圆窗膜显微注射的方法转染至小鼠内耳并表达,AAV2/9主要转染内毛细胞;DFNA5-Δexon8在小鼠耳蜗基底膜内毛细胞中呈现异常的颗粒样表达,但转染后小鼠未出现耳毒性表现。