恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤,由于其很高的致残、致死和复发率,已成为威胁人类健康的主要疾病之一。该类肿瘤患者即使经过手术、放疗和化疗等系统治疗,预后仍然较差。其中,最恶性的多形性胶质母细胞瘤患者经综合治疗后,其总体中位生存期也仅为12-15个月。一旦复发,该类患者的总体生存时间也仅为6-8个月。胶质瘤具有丰富的血管生成、很高的增殖能力和侵袭性。肿瘤细胞获得对抗细胞调亡的能力是其中的关键环节之一。因此,寻找胶质瘤细胞发生与进展中的关键分子,并针对该分子进行实验性靶向治疗,具有潜在的临床应用价值和广泛的社会意义。14-3-3蛋白是一类高度保守的小分子多功能酸性二聚体蛋白,存在于几乎所有真核生物中。在人类,它们有由不同基因编码的7个亚型,分别命名为β、η、ζ、ε、γ、θ和σ。14-3-3蛋白能通过磷酸化的丝氨酸/苏氨酸序列的方式与目标分子形成同源或异源二聚体。通过募集配体分子,14-3-3蛋白参与了调节多个细胞过程,包括有丝分裂、凋亡、细胞周期和侵袭。这些研究提示,14-3-3蛋白可能参与了肿瘤细胞的多条信号通路。我们前期的研究发现,14-3-3蛋白在人脑胶质瘤中呈强阳性表达,而在胶质细胞中则无表达或仅有弱表达,并与人脑胶质瘤的恶性级别及预后具有密切的相关性。用14-3-3蛋白特异性的抑制物difopein,抑制14-3-3蛋白与其配体分子之间的相互作用,或通过小干涉RNA下调14-3-3蛋白的表达,诱导了胶质母细胞瘤细胞的凋亡,提示14-3-3蛋白在细胞生存中具有重要作用,并为抑制14-3-3蛋白能够增加肿瘤的凋亡敏感性提供了依据。为进一步明确这种作用是由一个或多个14-3-3蛋白亚型引起的,我们进行了亚型特异性的表达检测。对14-3-3蛋白在星形胶质瘤的各亚型表达检测发现,14-3-3β和η在胶质瘤细胞中呈特异性高表达,并与胶质瘤的恶性级别明显相关。14-3-3ζ和ε在胶质瘤细胞和正常胶质细胞中均有表达,在胶质瘤细胞中的表达明显高于正常胶质细胞,并与胶质瘤的恶性级别明显相关。近年的多项研究还提示,14-3-3zeta在肺癌、乳腺癌等多类肿瘤的发生与进展中发挥了重要作用。目前,国内外尚无14-3-3zeta在胶质母细胞瘤的功能研究。基于此,本课题从以下6个方面进行了探讨。1.14-3-3zeta蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达及意义采用免疫组织化学方法检测了12例正常脑组织和47例人脑胶质母细胞瘤石蜡标本中14-3-3zeta蛋白的表达情况。结果显示,14-3-3zeta蛋白主要表达于正常脑组织中的神经元胞体和突起,而绝大多数胶质细胞中无14-3-3zeta蛋白的表达,仅在极少量的胶质细胞中可见弱阳性表达。14-3-3zeta蛋白主要表达于胶质母细胞瘤细胞的胞浆,呈明显的强阳性表达,其表达率约为74.5% (35/47)。结合相关研究,14-3-3zeta蛋白在胶质母细胞瘤中的强阳性表达提示其可能在胶质母细胞瘤中发挥了重要作用,这为下一步的研究奠定了基础。2.14-3-3zeta蛋白表达与胶质母细胞瘤患者预后的相关性研究47例胶质母细胞瘤患者依据14-3-3zeta蛋白的表达分为两组:14-3-3zeta阳性组(n=35)和14-3-3zeta阴性组(n=12)。收集每位患者的临床病理特征,并展开定期临床随访。通过Kaplan-Meier生存期分析、单因素和多因素回归分析,用以确定预后的相关因子。结果表明,14-3-3zeta阳性组患者的2年总体中位生存期(12.9月)和生存率(8.6%)明显低于14-3-3zeta阴性组患者的2年总体中位生存期(17.9月)和生存率(16.7%)(P=0.019)。14-3-3zeta的阳性组患者的术后复发间隔(5.9月)也短于14-3-3zeta阴性组患者(8.3月)(P=0.002)。单因素和多因素的方差分析提示,14-3-3zeta的阳性表达是重要的预后因子。因此,我们认为14-3-3zeta可作为判断胶质母细胞瘤患者预后的一个潜在指标。3. 14-3-3zeta蛋白阳性表达与胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡的相关性研究21例胶质母细胞瘤标本分别进行14-3-3zeta、Ki67免疫组织化学染色和TUNNEL染色,分析14-3-3zeta蛋白的表达(14-3-3zeta免疫组织化学评分表示)与胶质母细胞瘤细胞增殖与凋亡的相关性。肿瘤细胞的增殖指数(PI)用Ki67阳性细胞数表示,凋亡指数(AI)用TUNNEL阳性细胞数表示。结果提示,14-3-3zeta的阳性表达率为76.2%(16/21),免疫组织化学评分为6.29±3.57。增殖指数Ki67在所有肿瘤样本均有表达(50.08±13.98%),表达范围从27.8%到82.4%。凋亡指数AI也表达于所有肿瘤样本中(3.88±1.41%),表达范围从1.0%到6.4%。14-3-3zeta免疫组织化学评分与增殖指数PI呈正相关(r=0.870, P<0.001),与凋亡指数AI呈负相关(r=-0.975, P<0.001)。并且14-3-3zeta阳性组肿瘤标本的凋亡指数(3.47±1.19%)明显低于14-3-3zeta阴性组(5.2±1.13%, t=-2.77, P=0.012)。这些结果提示14-3-3zeta很有可能参与了胶质母细胞瘤细胞的增殖与凋亡。4.抑制14-3-3zeta蛋白表达对胶质母细胞瘤细胞体外增殖、凋亡和侵袭的影响以U251和U87细胞作为研究对象,通过逆转录病毒将14-3-3zeta RNAi片段和无关序列转入胶质母细胞瘤细胞,构建14-3-3zeta RNAi稳定转染细胞系。RT-PCR和Western blot证实,14-3-3zeta RNAi片段足够下调14-3-3zeta蛋白的表达。通过MTT实验、平板克隆实验、流术细胞仪(FCM)、细胞周期测定和Matrigel侵袭实验,检测14-3-3zeta基因表达下调后,胶质母细胞瘤细胞的生物学行为改变。MTT实验结果提示,与胶质母细胞瘤空白对照组和无关序列组相比,14-3-3zeta干涉组细胞的增殖能力明显下降(P<0.05),对U251和U87细胞接种7天后的抑制率分别为57.5±4.2%和53.6±3.4%。平板克隆实验结果提示,与空白对照组和无关序列组相比,下调14-3-3zeta基因的表达后,胶质母细胞瘤细胞U251的克隆形成能力分别降低了1.91和2.03倍,U87细胞的克隆能力下降了1.89和1.95倍。FCM结果提示,与空白对照组(0.8±0.1%)和无关序列组(2.2±0.4%)相比,14-3-3zeta干涉组细胞中早期凋亡和晚期凋亡均显著增多(P<0.05)。U251细胞的早期凋亡和晚期凋亡率分别达到了10.4±1.8%和15.1±2.3%。U87细胞的早期凋亡和晚期凋亡率分别达到了11.4±1.6%和12.6±2.8%,与空白对照组(0.5±0.1%)与无关序列组(1.5±0.4%)细胞相比,均有显著提高(P<0.05)。FCM测定细胞周期显示,与空白对照组与无关序列组细胞相比,14-3-3zeta干涉组细胞(U251和U87)G0/G1期细胞显著增多,G2/M期和S期细胞明显减少。Matrigel侵袭实验结果显示,与空白对照组(U251:46.3±7.1;U87:57.1±6.9)和无关序列组(U251:49.2±8.4;U87:62.2±7.8)细胞相比,14-3-3zeta干涉组细胞的侵袭能力显著下降(U251:24.1±3.2;U87:26.3±3.0)。为探索抑制14-3-3zeta基因后肿瘤细胞生物行为学改变的可能分子机制,我们检测了14-3-3zeta基因敲除后,与胶质母细胞瘤发生和进展相关分子的表达情况。结果提示,14-3-3zeta基因敲除引起了癌基因Cox2,c-Myc, Survivin和β-catenin以及侵袭相关基因E-cadherin的表达下调,而细胞周期相关基因CyclinD1未发生明显变化,尽管细胞周期停滞确实存在。这些结果提示我们,14-3-3zeta基因敲除后引起胶质母细胞瘤生物学行为的改变可能是一个多基因参与的复杂过程,更进一步的相关分子机制仍需阐明。我们的结果提示,抑制14-3-3zeta的表达能够显著降低胶质母细胞瘤的增殖和侵袭能力,诱导胶质瘤细胞凋亡和细胞周期停滞。以14-3-3zeta蛋白为靶点是治疗胶质母细胞瘤的一个潜在手段。5.抑制14-3-3zeta蛋白表达对胶质母细胞瘤细胞裸鼠体内成瘤性的影响在裸鼠成瘤实验中,我们将U87-KD细胞(稳定转染14-3-3zeta RNAi片段)、U87-SCR细胞(稳定转染无关序列)和U87-PAR细胞(空白对照)分别接种于裸鼠右侧股部建立裸鼠移植瘤模型。每周观察并记录肿瘤的生长情况,测定肿瘤最大径与最小径,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。6周后将裸鼠处死,称肿瘤重量。结果显示,与无关序列组和空白对照组相比,14-3-3zeta干涉组裸鼠形成肿瘤的时间延迟,生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均有明显减少(U87-PAR:1.63±0.37g;U87-SCR:1.58±0.41g;U87-KD:0.73±0.26g;P<0.05)。Ki67免疫组织化学染色和TUNNEL染色阳性细胞数分别表示肿瘤增殖指数与凋亡指数。结果显示,与空白对照组(Ki67:36.2±6.1;TUNNEL:3.7±1.5)和无关序列组(Ki67:34.5±5.5;TUNNEL:4.5±1.6)相比,14-3-3zeta抑制组的瘤组织凋亡指数增加,增殖指数下降(Ki67:18.3±3.1;TUNNEL:24.8±4.9;P<0.05)。上述结果提示,抑制14-3-3zeta的表达减缓移植瘤的生长,可能是通过降低瘤细胞的增殖和诱导瘤细胞的凋亡来实现的。6.14-3-3zeta蛋白在胶质母细胞瘤干细胞中的表达及潜在的生物学意义为了进一步明确14-3-3zeta对胶质母细胞瘤的作用,我们从12例胶质母细胞瘤组织中分离培养了5株胶质母细胞瘤干细胞。首先将肿瘤组织消化成单细胞,用肿瘤干细胞培养液培养直至形成克隆球,进行CD133染色。去除肿瘤干细胞培养液后,换成含10%血清的正常培养基,进行分化实验(GFAP和β-tubulin染色)。同时将1000个胶质母细胞瘤细胞种植于裸鼠,在裸鼠皮下形成可见的肿瘤,取瘤组织重新进行肿瘤干细胞培养依然能够形成克隆球。将培养鉴定的肿瘤干细胞进行14-3-3zeta免疫细胞化学染色。结果提示,胶质母细胞瘤干细胞中14-3-3zeta呈阳性表达。14-3-3zeta蛋白可能在扮演肿瘤起源的肿瘤干细胞中发挥了重要作用,但具体作用仍需进行深入研究。综上所述,本研究首次在国内外证实14-3-3zeta蛋白在人脑胶质母细胞瘤形成、发展以及侵袭过程中的发挥了关键作用,其作用机制可能是通过抑制肿瘤细胞的凋亡来实现的。在肿瘤干细胞中其表达阳性提示14-3-3zeta可能作用于肿瘤干细胞而影响了胶质母细胞瘤的发生与进展。以14-3-3zeta蛋白为作用靶点进行胶质母细胞瘤的治疗具有潜在的临床应用价值,并为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的干预措施。