膀胱肿瘤是我国最常见的泌尿系肿瘤,随着生活条件的改善以及生活环境的改变,其发病率呈逐年增高的趋势。膀胱癌90%以上为移行上皮细胞癌,其中浅表型膀胱癌占70%左右。浅表型首选采用经尿道膀胱肿瘤电切术进行治疗。但复发率高,为预防浅表性膀胱癌电切术后复发,术后进行膀胱内灌注药物治疗是目前最有效的治疗措施。临床上采用的向膀胱内灌注羟基喜树碱、吡柔比星、卡介苗等是最简单、有效且常用的一种方法。灌注治疗后,表浅性TCC电切术后复发率可以下降20%左右,但复发率仍有30-50%。而且不论采取何种预防治疗措施,10-15%的肿瘤向膀胱肌层浸润发生率不会改变。目前认为膀胱癌术后辅助治疗是治疗的关键。近年来的研究表明NO也是肿瘤细胞凋亡所必须的调节信号之一,NO在肿瘤发生发展中起双向作用。实验证实NO在发挥细胞毒或介导细胞凋亡的浓度要比促进血管生成的浓度高10-100倍,即NO的双向作用是浓度依赖性的,适宜的低浓度促进肿瘤生长,高浓度时则抑制肿瘤生成,促进细胞凋亡。因此激发肿瘤细胞释放高浓度的NO可能是一个治疗肿瘤的新方法。多种途径可以达到高浓度NO,如在癌细胞中转染iNOS基因及直接补充外源NO等,但前者明显优于直接补充外源NO。虽然内源性和外源性的NO将会是很有前途的化疗、放疗及免疫治疗等的辅助治疗剂,但相对其它领域而言,其在膀胱移行细胞癌中生物学效应的研究还有一定的差距。目前国内外尚未见报道将iNOS基因应用于膀胱移行细胞癌的实验性研究。多种方法可以合成分泌高浓度NO,文献多采用NO供体如硝基扩血管药物,作为模拟体内高浓度NO的研究手段,但存在耐药性差、副反应大等缺陷。亦有方案是通过活化淋巴细胞直接调节宿主的免疫应答,这一领域的治疗主要是依赖IFN-α、β、γ和IL-2,由于特异性不强、毒性大等原因大多没有广泛应用。所以采用药物NO供体或细胞因子刺激产牛NO有很多局限性。基因治疗是指借助基因工程方法将特定的外源基因导入动物或人的组织细胞,使其整合、表达,以达到治疗的目的。肿瘤发生的复杂性使正确的选择基因转移方法及基因治疗策略成为基因治疗的关键。本研究试图通过腺病毒介导的方法将外源性iNOS导入膀胱移行细胞癌细胞T24中,上调细胞内iNOS基因的表达,促使细胞释放大量NO,提高细胞内NO的浓度,从而干扰细胞的生长周期,诱导细胞发生凋亡。以腺病毒介导的基因转移技术在肿瘤基因治疗中应用较为普遍,目的基因可以整合到病毒基因组而后随病毒一起感染宿主细胞。腺病毒具有嗜膀胱细胞的特性,而膀胱又是一个半开放器官,这使应用腺病毒载体进行膀胱癌的基因治疗成为可能。基因治疗联合现有治疗方法寻找对抗膀胱癌复发的新思路和新途径已成为研究热点。目前国内外尚无报道将iNOS应用于膀胱移行细胞癌,因此我们在既往研究的基础上选择本课题研究,希望将iNOS应用于膀胱移行细胞癌的基因治疗能为临床有效治疗膀胱移行细胞癌提供一个新的思路。为了充分利用腺病毒载体进行膀胱癌基因治疗的优势,弥补其不足,也为了降低传统化疗药物的细胞毒性,提高对膀胱移行细胞癌的治疗效果,我们采用联合小剂量化疗药物(HCPT、THP)对人膀胱移行细胞癌T24细胞进行体外杀伤,并进行比较,为腺病毒介导的iNOS的基因疗法联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。本课题由三部分组成。目的：利用腺病毒表达系统构建携带iNOS基因的重组腺病毒载体,并获得rAd-iNOS重组腺病毒,用于后续对T24细胞作用的研究。本实验在先前工作的基础上,将iNOS基因开放阅读框(open reading frame, ORF)片段先亚克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1,然后体外重组至腺病毒载体pAd/BL-DEST,构建重组腺病毒载体,并转染HEK293细胞进行腺病毒包装,从而获得重组腺病毒rAd-iNOS。方法：为确保模板质粒pReceive-M29-iNOS的正确性,将模板质粒进行序列测定。测序正确后,双酶切pReceive-M29-iNOS及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1,琼脂糖凝胶电泳检测后分别回收iNOS片段的带和线状pYr-adshuttle-1载体带,连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,摇菌扩增,提取重组质粒pYr-adshuttle-1-iNOS,进行酶切鉴定和DNA测序。将鉴定正确的重组质粒采用LR体外同源重组将iNOS表达框亚克隆至腺病毒表达载体pAd/BL-DEST, PacI酶切重组腺病毒载体pAd-iNOS,使重组腺病毒载体线性化后转染包装细胞HEK 293,包装成重组腺病毒rAd-iNOS, PCR鉴定并测定病毒滴度。结果：经测序,模板质粒pReceive-M29-iNOS的DNA序列分析结果与预期结果完全相符,与NCBI公布的iNOS的ORF进行序列比对,正确性高达100%；经酶切分析、测序结果表明腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-iNOS和腺病毒载体pAd-iNOS构建成功；经PCR鉴定,重组腺病毒rAd-iNOS包装成功,其滴度达5.8×108PFU/ml。结论：成功构建了重组腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-iNOS和重组腺病毒载体pAd-iNOS后,采用HEK293细胞进行腺病毒包装,最终获得重组腺病毒rAd-iNOS。目的：在成功构建了含有iNOS基因的重组腺病毒rAd-iNOS后,使之感染人膀胱移行细胞癌细胞T24,探讨iNOS基因对T24细胞的生长、增殖和凋亡的影响。方法：培养T24细胞后,用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒rAd-EGFP来测定腺病毒对T24细胞的最适感染复数。感染前24h取指数生长期的T24细胞,实验共设3组：重组腺病毒rAd-iNOS感染组、对照腺病毒rAd-NC感染组、空白对照组,当细胞密度达到60%-70%时,加入100 MOI重组腺病毒或对照腺病毒,置于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时,更换为新鲜完全培养基,培养48h后胰酶消化收集各孔细胞进行后续的实验研究。RT-PCR检测各组细胞iNOS、p53的mRNA水平；Western检测各组细胞中iNOS及p53的蛋白表达差异；NO检测试剂盒检测各组细胞NO分泌水平；荧光显微镜下观察各组细胞凋亡坏死情况；流式细胞分析法检测各组细胞凋亡。结果：重组腺病毒rAd-iNOS感染T24细胞48h后,RT-PCR结果显示,重组腺病毒rAd-iNOS感染组的iNOS基因mRNA水平及突变型p53基因的mRNA水平显著高于对照腺病毒感染组和空白对照组。western检测iNOS、p53的蛋白表达,结果显示重组腺病毒rAd-iNOS感染组的iNOS及p53的蛋白表达水平均显著高于其他两对照组。NO含量测定显示,T24细胞感染重组腺病毒rAd-iNOS后,细胞分泌NO水平显著提高(p<0.05)。荧光显微镜下观察细胞,重组腺病毒rAd-iNOS感染T24细胞后生长状态变差,形态学恶性表型减轻。流式细胞术检测提示感染重组腺病毒rAd-iNOS的T24细胞较对照腺病毒感染细胞和未转染空白组细胞凋亡率高,其差异具有显著性(p<0.05)。结论：采用重组腺病毒rAd-iNOS成功转染膀胱移行细胞癌T24细胞后,高表达iNOS蛋白,并能够诱导细胞分泌高浓度的NO,同时p53蛋白的表达也随之增强,促进膀胱癌T24细胞的凋亡,为膀胱癌基因治疗开辟了一条新的途径,为进一步的研究奠定了坚实的实验基础。目的：采用重组腺病毒rAd-iNOS联合小剂量化疗药物(HCPT.THP)对人膀胱癌T24细胞进行治疗,观察其对细胞的杀伤作用。方法：实验以未感染的T24细胞为空白对照,取处于对数生长期,生长状态良好的T24细胞接种至96孔板,每组3个复孔,加入培养基,待T24细胞贴壁6-8小时后,用重组腺病毒充分感染。参考先前的工作经验,HCPT、THP浓度取对T-24杀伤作用不明显的小剂量的浓度梯度。分别将rAd-iNOS、rAd-iNOS+HCPT (THP)加入孔板中,以正常T24细胞为空白对照,显微镜下观察各组细胞的形态；以MTT法检测药物作用于感染后膀胱癌细胞24h、48h、72h细胞的存活率。结果：rAd-iNOS+HCPT各组和rAd-iNOS感染组相比,对转染后细胞有明显的杀伤作用,且作用明显的增强(P＜0.05), rAd-iNOS+ HCPT组随HCPT浓度增高和作用时间的延长,杀伤效率明显增高(P<0.05); rAd-iNOS+HCPT各组对转染后T24细胞也均较rAd-iNOS感染组和空白组有显著的增强,各组之间的杀伤效率随着浓度梯度的增加也有明显增高(P<0.05)。结论：重组腺病毒rAd-iNOS联合小剂量化疗药物羟基喜树碱或吡柔比星能增强iNOS基因对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用,为iNOS基因联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据