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研究背景细菌耐药可以引起患者抗生素使用后效果不明显,医治难度增加甚至病死率上升等严重后果,已经成为全球共同面临的严峻公共卫生问题之一。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBL)是一类能够水解β-内酰胺类药物的酶,ESBL可通过质粒上的编码基因完成在菌株之间水平传播耐药性,是肠杆菌科细菌出现抗生素耐药的主要方式。产ESBL菌株中最常见的是大肠埃希菌,其在医院患者中的携带率为31.5%～55.8%,在山东省农村居民中的携带率可达42%。ESBL的耐药基因型主要有CTX-M、SHV和TEM,我国临床患者中流行的主要是CTX-M,尤其是CTX-M-14和CTX-M-15。山东省是全国的养猪大省,除规模化养殖外,还有数量众多的散养户,由于与养殖动物接触密切,这些养殖户居民是动物源耐药菌传播给人的重点人群。调查研究该类人群的ESBL携带情况,有助于掌握当前山东省养殖地区农村居民中产ESBL大肠埃希菌的流行现状,耐药情况及分子分型特点,进而找到耐药菌传播途径,为今后控制抗生素耐药的蔓延提供理论依据。研究目的1.了解山东省养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的流行现状;2.掌握山东省养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的药物敏感性和耐药基因特点;3.描述山东省养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的分子分型特点;4.通过分析养殖地区农村居民产ESBL大肠埃希菌的耐药基因特点和分子分型特点,探讨耐药菌传播途径,从而对今后控制抗生素耐药的蔓延提供理论依据。研究方法1.样本采集:本研究基于"IMPACT"中-瑞国际合作项目,项目选择山东省某生猪养殖县某养殖镇的12个村作为研究现场,本研究在12个村中随机抽取4个村,在每村居民中随机抽取40位成年常住居民,采集其粪便样本,并收集居民的年龄、性别和养猪情况;2.产ESBL大肠埃希菌的分离和鉴定:采用ESBL筛选性培养基直接筛选目的菌株,利用VITEK质谱仪完成菌株型别的鉴定。3.ESBL确证试验和药物敏感性试验:根据2015版CLSI指南,采用纸片法进行ESBL确证试验,采用琼脂稀释法进行药物敏感性试验。4.耐药基因检测:通过PCR扩增、毛细管电泳以及DNA测序的方法分析产ESBL大肠埃希菌所携带的耐药基因型别。5.分子分型分析:通过MLST和PFGE两种方法进行分子分型分析。主要结果1.产ESBL大肠埃希菌的携带率160位农村居民中有130人携带产ESBL的大肠埃希菌,携带率为81.3%,共分离到184株目的菌株。各村居民的携带率分别为75.0%、80.0%、77.5%和92.5%。女性和男性居民的携带率分别为84.5%和78.7%,养猪居民和非养猪居民的携带率为83.3%和80.0%,"<50岁"居民、"50～59岁"居民和"≥60岁"居民的携带率分别为86.8%、87.0%和63.2%。2.产ESBL大肠埃希菌的药物敏感性(1)研究菌株对14种抗菌药物的药物敏感性,除去动物专用药物氟苯尼考,剩余13种属于11类。分析产ESBL大肠埃希菌对这11类人常用抗菌药的耐药谱,多重耐药率达91.8%,耐3-5类药物的比例为56.0%(103/184),耐6-8类药物的比例为35.9%(66/184)。养猪是导致居民对氟苯尼考重度耐药(MIC=64)的危险因素(OR=2.121,95%CI:1.034～4.353),同时也是导致居民>5重耐药的危险因素(OR=1.995,95%CI:1.080～3.686)。产 ESBL 大肠埃希菌对 CTX、TET 和SXT这三种抗菌药物的耐药率超过80%,耐药率分别为100.0%、87.0%、82.1%;耐药率居于其次的是 CIP(64.7%)、FFN(56.5%)、GEN(53.8%)、PTZ(31.0%)、FO(29.9%)、AMC(20.1%)、NIT(13.0%);耐药率低于 10.0%的抗菌药物有AMI(7.1%)、CFX(4.9%)、MEM(0.0%)、TGC(0.0%)。(2)检测产ESBL大肠埃希菌中耐药基因CTX-M、SHV和TEM的携带情况,结果显示CTX-M的检出率为100.0%,共检出10种亚型,优势型是CTX-M-14,占 37.0%(68/184),其次是 CTX-M-55、CTX-M-65 和 CTX-M-15,分别占 17.4%(32/184)、16.3%(30/184)和 14.1%(26/184)。SHV 和 TEM 均未检出。3.分子分型(1)在184株产ESBL的大肠埃希菌中随机选择54株进行PFGE分子分型分析,结果这54株菌株属于35种基因指纹图谱型别,同源性在63.8%到93.0%之间。指纹图谱显示不同村居民之间、养猪居民和非养猪居民之间,所分离的产ESBL大肠埃希菌都存在同源性大于80%的现象,即菌株间存在同源性。(2)MLST结果显示,184株产ESBL的大肠埃希菌中有172株基因序列与MLST基因库中的ST序列匹配,属于81种ST(sequence types)型,其余12株未找到匹配的ST型,属于新发现,下一步将提交到MLST网站对新ST型命名。本研究中大肠埃希菌的ST型呈现多样性,型别最多的是ST10,占8.1%(14/172);其次分别为 ST38 型,占 5.8%(10/172);ST48 型,占 5.8%(10/172);ST6338 型,占3.5%(6/172);ST46型,占2.9%(5/172);ST648 型,占2.9%(5/172)。其余75种ST型仅有5株以下与其对应。结论1.山东农村养殖地区居民中产ESBL大肠埃希菌广泛流行,耐药形势比较严峻;2.山东农村养殖地区居民所携带的产ESBL大肠埃希菌分子分型表现为多样性;3.动物源性耐药基因CTX-M-55和CTX-M-65在本地区居民中广泛流行,畜禽中广泛流行的序列型ST10在本地区居民中多见,可初步证明耐药性有从畜禽向人类传播的趋势。