研究背景与目的:常染色体显性多囊肾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最为常见的遗传性肾病,也是导致全球终末期肾脏病的第四大原因。其病因是pkd1或pkd2基因的突变,该类突变的遗传特征符合常染色体显性遗传规律。除去已知的胞内信号转导通路直接影响疾病进展以外,肾脏的炎性微环境也在多囊肾的发展中有着重要作用,炎症微环境以炎症细胞的浸润和炎症因子的产生为特征。白细胞介素-1(IL-1,包括IL-1 alpha和IL-1 beta)是固有免疫系统中典型的促炎性细胞因子。前人曾报道过在ADPKD患者中,尿IL-1受体拮抗蛋白下调。但是就我们所知,IL-1信号通路在ADPKD疾病进展中的作用尚未被直接研究过。我们研究小组关注IL-1在ADPKD中的调节,IL-1是否影响疾病进展及其可能的通过细胞程序性坏死调节疾病进展的机制。明确该内容有助于进一步理解ADPKD的发病机制,也有可能对发现治疗关键靶点和开发药物有重大科学意义。方法:1.培育肾脏特异性敲除pkd1的小鼠,以定量PCR技术检测相较于野生型对照组小鼠的肾脏中,IL-1 alpha和IL-1 beta在有囊肿的肾脏中表达水平的调节。同时利用对应的两组肾脏组织提取肾小管原代细胞进行离体培养。研究在离体培养条件下这两种炎症因子的变化是否与在体一致。2.利用肾脏特异性pkd1敲除和IL-1 R全身敲除的双敲除小鼠(IL-1 R KO KPKD1)与只有肾脏特异性pkd1敲除的单敲除小鼠(IL-1 R WT KPKD1)对比进行生存分析,与此同时,进行两组同日龄小鼠肾重体重比和病理切片计算的囊肿指数分析,以明确在pkd1敲除的基础上敲除IL-1 R是否影响疾病进展。3.通过上述步骤明确IL-1与ADPKD进展的关系,进而探索其背后机制。利用在步骤2中的肾脏特异性pkd1敲除和IL-1 R全身敲除的双敲除小鼠,使用定量PCR技术筛查由IL-1信号缺失所造成的下游炎症因子表达变化。4.在步骤3中我们发现肾脏特异性pkd1敲除和IL-1 R全身敲除的双敲除小鼠相较于pkd1肾脏特异性敲除小鼠TNF-alpha的表达水平上调,由于TNF-alpha是经典的细胞凋亡和程序性坏死的诱导剂,我们进一步验证了敲除IL-1 R后肾脏凋亡与细胞程序性坏死的水平是否受到影响。5.利用人类ADPKD标本以及肾脏特异性敲除pkd1的小鼠模型,以免疫印迹和定量PCR技术检测细胞程序性坏死标志蛋白RIP1,RIP3以及MLKL在ADPKD疾病状态下的调节。6.出生后第一天即给予肾脏特异性pkd1敲除小鼠细胞程序性坏死抑制剂Nec-1,连续给药6天后处死小鼠,而对照组小鼠为同基因型同日出生小鼠,但只给予溶媒,与同样肾脏特异性pkd1敲除基因型但只给予溶媒的小鼠相比较,我们分析了阻断细胞程序性坏死后囊肿进展速度,测量指标为肾重体重比和由病理切片计算的囊肿指数。结果:1.我们发现IL-1两种亚型在ADPKD组织中均明显上调。同时利用对应的两组肾脏组织提取肾小管原代细胞进行离体培养。在离体培养条件下,IL-1 alpha和IL-1beta水平下调。这意味着在体情况下IL-1的上调是由于多囊肾组织局部微环境的促使而非pkd1突变本身导致。2.根据前述结果,在体状态下肾脏IL-1在ADPKD中明显上调,为了直接探究IL-1信号通路在ADPKD疾病进展中的作用。我们使用了KPKD1与IL-1受体双敲除(IL-1 R KO KPKD1)的小鼠作为实验组,而KPKD1单敲除但表达正常的IL-1受体水平的小鼠作为对照组。并对疾病进展情况加以分析。Pkd1 flox/flox Ksp Cre+小鼠模型属于非常激进的囊肿进展的模型,该基因型的小鼠在21天以前即会死亡,与单敲小鼠相比,双敲小鼠的中位生存期(17天)长于单敲小鼠(15天),我们同时检测了两组小鼠的肾重体重比以及形态学表现。在出生后第8天双敲小鼠的肾重体重比低于单敲小鼠,同时我们可以发现双敲小鼠肾脏囊肿指数较单敲小鼠低。3.我们进一步研究了IL-1 R的额外敲除可以带来保护作用的可能原因。因为IL-1信号通路对于介导固有免疫反应至关重要,所以我们认为IL-1在ADPKD中加重疾病进展的作用是通过调节肾内炎症因子水平而发挥的。我们因此使用了上述IL1 R WT KPKD1与IL1 R KO KPKD1小鼠,并检测了其肾脏组织的相关典型炎症因子。IL-1 R的mRNA水平变化证明了两组在IL-1 R表达上的差别,从而验证了敲除效率。IL-6,ccl2,ccl3,Arg1和TGF-beta这些炎症指标在两组间未见有统计学意义的差别,凋亡相关的caspase3与caspase8同样未见有统计学意义的差别。TNFalpha的结果显示在pkd1与IL-1 R双敲组更高。我们通过免疫印迹手段验证了TNFalpha水平在两组之间的差异。我们推断这有可能是导致更多细胞死亡以及相对的囊肿进展减缓的原因。4.我们接下来检测了可能的通过TNF-alpha作用而影响疾病进展的机制。由于TNF-alpha是经典的细胞凋亡和程序性坏死的诱导剂,我们在上述小鼠模型中检测了细胞凋亡与程序性坏死的标志物。我们发现,在mRNA水平上,MLKL在IL1 R KO KPKD1组肾脏中明显上调,这意味着细胞程序性坏死的上调。而细胞凋亡相关标志物caspase 3与caspase 8并没有表达上调。因此,通过降低小管上皮细胞净生存率,由TNF-alpha介导的细胞程序性坏死的水平上升可以在缺失IL-1信号的情况下延缓疾病进展。5.为了阐明细胞程序性坏死是否是在人类ADPKD中同样出现异常调节的现象,我们研究了人类标本中细胞程序性坏死标志物的表达。免疫印迹的结果显示RIP3与MLKL的磷酸化水平在ADPKD患者中升高。上述人类肾脏标本行p-MLKL的免疫组化染色除了显示出ADPKD患者的MLKL磷酸化水平更高以外,还指示出其分布局限于小管上皮细胞。除了人类标本以外,我们也应用了KPKD1小鼠进行验证。在出生后第八天,KPKD1与对照组小鼠均处死,与对照组相比,实验组的RIP3与MLKL的mRNA水平有明显上升。这与人类标本中所见结果一致,而免疫印迹结果显示KPKD1组小鼠的肾脏中RIP3与MLKL的磷酸化水平亦有明显上调。在从KPKD1小鼠体内分离出来的小管上皮原代细胞中,我们也做了相同的检测,KPKD1组的原代上皮细胞中RIP3与MLKL的mRNA水平较对照组升高均约1.5倍,这与在体研究中的>10倍和>2倍差距较大。这意味着在体状态下ADPKD的局部炎症微环境可能介导了TNF-alpha依赖的细胞程序性坏死。6.我们进一步检测了细胞程序性坏死在囊肿进展中是否发挥作用。对pkd1 flox/flox Ksp Cre+小鼠使用nec-1、阻断细胞程序性坏死,经免疫印迹验证给予Nec-1抑制了MLKL及RIP3的磷酸化水平,在此基础上相较于同日龄的注射溶媒的对照组pkd1 flox/flox Ksp Cre+敲除小鼠,被Nec-1处理过的小鼠肾重体重比更大,肾脏囊肿指数相较于对照组有更高的趋势,由此可见在未加干预的情况下pkd1 flox/flox Ksp Cre+小鼠的上调的细胞程序性坏死起到一定的对抗疾病进展的作用。也即是说上一部分检测到的细胞程序性坏死在pkd1 flox/flox Ksp Cre+小鼠中的上调是反馈性的。结论:我们发现在ADPKD中,IL-1 R激活导致了囊肿指数和肾重体重比上升,这可以归结于细胞程序性坏死的受抑。在pkd1敲除的小鼠模型中,IL-1 R激活可以通过抑制TNF-alpha来限制细胞程序性坏死。这样,IL-1 R激活致使ADPKD恶化的原因并非上调局部炎症微环境,而是下调了局部炎症进而导致依赖炎症因子的小管上皮细胞程序性坏死过程受到抑制。我们观察到的多种ADPKD模型中均出现的细胞程序性坏死的上调可能代表了一种在上皮细胞增生过度情况下的保护性反馈。因此,阻断IL-1 R通路和刺激细胞程序性坏死值得进一步研究,其可能成为延缓ADPKD进展的潜在治疗方式。现有的针对IL-1信号通路的药物(如anakinra)对ADPKD患者应用时需要更加审慎,因为其可能影响下游TNF-alpha的产生进而对PKD的进展产生影响。