目的:本研究以脉络学说营卫理论为指导，采用胸主动脉缩窄术建立压力超负荷大鼠模型，通过观察心衰时心脏微血管结构与功能损伤、心肌凋亡和纤维化、心肌线粒体为核心的糖脂能量代谢异常，初步揭示微血管病变在心衰发病中的重要作用及其对心室重构、代谢重构的影响与芪苈强心胶囊干预作用；采用灌注衰竭大鼠心脏模型，进一步观察芪苈强心胶囊对能量代谢AMPK/PPARα信号通路的干预作用和对线粒体相关蛋白的影响。通过上述整体与离体实验研究，探讨微血管损伤、心室重构、代谢重构在心力衰竭发病中的影响及芪苈强心胶囊干预作用，为揭示脉络学说营卫“由络以通、交会生化”理论的科学内涵提供实验依据。方法:本研究分为以下四部分内容：1心力衰竭大鼠心肌微血管损伤及芪苈强心胶囊干预作用研究以SD大鼠为研究对象，采用胸主动脉缩窄术建立压力超负荷致心力衰竭模型，分为正常对照组（Control）、假手术组（Sham）、模型组（Model）、卡托普利组（Captopril）、芪苈强心低、中、高三个剂量组（QLQX-L、QLQX-M、QLQX-H），共7组，每组15只，灌胃给药1次/日，连续6周，正常对照组、假手术和模型组给予同体积羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶剂，给药量均为10ml/kg体重。末次给药后禁食12h，各组大鼠行颈动脉插管观察血流动力学变化；放免法检测N端脑钠肽前体（NT-proBNP）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）含量；ELISA法检测去甲肾上腺素（NE）、内皮素-1（ET-1）、血管性血友病因子（vWF）水平。透射电镜观察各组大鼠心肌组织微血管内皮细胞超微结构变化；运用免疫荧光技术观察芪苈强心对压力超负荷致心力衰竭大鼠心肌微血管密度的影响；采用Real-time PCR检测心肌中与炎症相关的细胞粘附因子ICAM-1、VCAM-1mRNA表达，以及反映血管内皮功能的eNOS mRNA表达量。2心力衰竭大鼠心室重构及芪苈强心胶囊干预作用研究实验分组、造模方法同第一部分。心肌组织一般形态学及超微结构变化：HE染色观察心肌组织形态学改变；透射电镜观察超微结构变化。心肌胶原纤维增生情况：记录心重指数；Masson三色染色观察心肌胶原纤维增生情况；碱水解法检测心肌组织羟脯氨酸水平；Western blot检测心肌组织胶原Ⅰ、Ⅲ（COLⅠ、COLⅢ）表达量。心肌细胞凋亡情况：采用流式细胞技术及TUNEL原位细胞凋亡检测心肌细胞凋亡率；Real-time PCR检测心肌营养素-1（CT-1）、细胞色素C（CytC）mRNA表达量。3心力衰竭大鼠代谢重构及芪苈强心胶囊干预作用研究实验分组、造模方法同第一部分。检测血清乳酸（LA）、乳酸脱氢酶（LDH）、游离脂肪酸（FFA）、尿酸（UA）含量；高效液相色谱法测定ATP、ADP、AMP含量，计算心肌组织总腺苷池及能荷值；运用流式细胞技术检测心肌细胞线粒体膜电位（MMP）；溶解氧电极检测线粒体氧化呼吸活性（RCR）；Real-time PCR检测CPT-Ⅰ、GLUT4、PGC-1α基因相对表达量；Western blot检测p-AMPK、AMPK、PPARα、PGC-1α蛋白表达水平。4芪苈强心胶囊改善离体衰竭心脏能量代谢的机制研究本部分研究采用离体Langendorff心脏灌流装置，低钙K-H液灌注制作离体心力衰竭模型，以去乙酰毛花苷注射液为阳性对照药，芪苈强心设立0.025、0.05、0.1、0.2、0.4g/L5个浓度组（分别为QLQX-0.025、QLQX-0.05、QLQX-0.1、QLQX-0.2、QLQX-0.4），另设AMPK阻断剂组（Compound C）和PPARα阻断剂（MK-886）观测芪苈强心对离体衰竭心脏的左室内压、左室负荷变化及冠脉流量的影响；检测各组总腺苷酸池及能荷值；Real-time PCR检测α-MHC、β-MHC、Mfn2、Drp1mRNA表达；Western blot检测离体心脏AMPK、PPARα、p-PI-3K、p-Akt蛋白表达水平。结果:1心力衰竭大鼠心肌微血管损伤及芪苈强心胶囊干预作用研究各组大鼠血流动力学测定结果：与假手术组比较，模型组SBP、LVSP、LVEDP显著升高，±dp/dtmax明显降低（P<0.05）；与模型组比较，各给药组均降低SBP、LVSP、LVEDP水平，升高±dp/dtmax水平（P<0.01），尤以QLQX-H组效果显著。AngⅡ、ALD、NE、NT-proBNP含量变化：与假手术比较，模型组大鼠上述指标含量均显著增高（P<0.01）；与模型组比较，QLQX-M，QLQX-H组降低NE和NT-proBNP水平（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，QLQX-M、QLQX-H组AngⅡ、ALD水平明显降低（P<0.01）。心肌组织微血管超微结构显示：模型组毛细血管周围明显水肿，基膜不整、管腔不规则，未见明显线粒体结构，紧密连接模糊，吞饮小泡数目减少。各给药组不同程度改善毛细血管内皮结构，表现在线粒体融合、空泡化减轻，吞饮小泡数目相对增多，紧密连接较明显。各组心肌组织微血管密度：与假手术组比较，模型组CD34阳性计数和微血管相对密度均显著降低（P<0.01），各组DAPI计数无统计学差异。与模型组CD34阳性数比较，QLQX各剂量组明显增加CD34阳性数（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各给药组心肌组织微血管相对密度均显著增加（P<0.01）。血清ET-1、vWF水平：与假手术组比较，模型组ET-1、vWF含量明显增高（P<0.01）；与模型组比较，给药组ET-1含量均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，芪苈强心各剂量组显著降低降低vWF含量（P<0.05，P<0.01）。炎症因子ICAM-1、VCAM-1以及eNOS mRNA表达：与假手术组比较，模型组心肌组织ICAM-1、VCAM-1表达量均显著升高（P<0.01），而eNOS mRNA表达量明显降低（P<0.01）。与模型组比较，QLQX-H组降低ICAM-1表达（P<0.01）；QLQX-M、QLQX-H组均显著降低VCAM-1mRNA表达量（P<0.01）；芪苈强心各剂量组不同程度上调eNOSmRNA表达（P<0.05，P<0.01），以QLQX-H组效果显著。2心力衰竭大鼠心室重构及芪苈强心胶囊干预作用研究2.1心肌组织形态学及超微结构观察结果：HE染色结果观察：与假手术组比较，模型组心肌纤维肥大，局部可见断裂、萎缩变性的肌纤维。给药干预后大体情况基本接近正常。透射电镜观察结果显示模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，Z线可见断裂、消失，心肌间质及核周明显水肿，糖原减少；线粒体形态不一、膜结构不清、部分膜融合，嵴紊乱、融合或消失，可见线粒体空化现象。各给药组不同程度减轻心衰大鼠心肌组织上述超微结构改变。2.2各组大鼠心重指数、胶原纤维、羟脯氨酸含量及心肌COLⅠ、COL Ⅲ蛋白表达水平的变化：各组大鼠心重指数结果：与正常组、假手术组比较，模型组心重指数明显增加（P<0.01）；与模型组比较，各给药组可明显降低心重指数（P<0.05，P<0.01），尤以QLQX-H组降低效果显著。心肌组织胶原纤维的变化：Masson三色染色显示，正常组、假手术组心肌纤维束排列紧密有序，未见明显胶原纤维增生；模型组局部可见大面积胶原增生，并蔓延于心肌纤维束间，呈网状分布。各给药组可不同程度抑制心肌及血管周围胶原纤维的增生。各组心肌组织羟脯氨酸含量的变化：与假手术组比较，模型组羟脯氨酸含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，各给药组明显降低羟脯氨酸含量（P<0.05，P<0.01），尤以QLQX-H组降低效果最明显。各组大鼠心肌COLⅠ、COLⅢ蛋白表达变化：与假手术组比较，模型组COLⅠ、COLⅢ蛋白显著上调（P<0.01），与模型组比较，QLQX-H组和卡托普利组COLⅠ的表达水平显著下调（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，QLQX-M和QLQX-H组显著降低COLⅢ蛋白表达（P<0.01）。2.3各组大鼠心肌细胞凋亡的变化：TUNNEL结果显示，模型组心肌组织凋亡细胞明显增多，给予药物治疗后凋亡细胞减少；流式细胞技术结果显示与假手术组比较，模型组心肌细胞凋亡明显增加（P<0.01），与模型组比较，各给药组心肌细胞凋亡率显著降低，均具有显著统计学意义（P<0.01）。各组心肌组织CT-1、CytC mRNA表达水平的变化：与假手术比较，模型组CT-1，CytC mRNA表达水平显著上调（P<0.01），与模型组比较，各给药组CT-1，CytC mRNA表达水平明显降低（P<0.05，P<0.01）。3心力衰竭大鼠代谢重构及芪苈强心胶囊干预作用研究各组大鼠血清LA、LDH、FFA、UA含量的变化：与模型组比较，QLQX-L、QLQX-H组大鼠血清LA含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。芪苈强心各剂量组均显著降低LDH、FFA、UA水平（P<0.05，P<0.01），其中QLQX-H组降低FFA、LA含量显著优于卡托普利组（P<0.05，P<0.01）。各组大鼠心肌组织总腺苷酸池及能荷值变化：与假手术组比较，模型组总腺苷酸与能荷值均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，药物干预组腺苷酸池和能荷值均显著增加（P<0.05，P<0.01）各组大鼠心肌组织线粒体MMP与RCR变化：与假手术组比较，模型组心肌线粒体MMP与RCR明显下降（P<0.01）。与模型组比较，各给药组心肌线粒体MMP均升高（P<0.05，P<0.01）；各给药组均可改善线粒体呼吸功能、提高RCR（P<0.05，P<0.01）。各组CPT-Ⅰ、GLUT4、PGC-1α mRNA表达的变化：与假手术组比较，模型组上述指标mRNA表达量均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，QLQX-H组和卡托普利组明显上调CPT-Ⅰ、GLUT4和PGC-1α mRNA表达（P<0.05，P<0.01）。各组大鼠心肌组织中p-AMPK、AMPK、PPARα、PGC-1α蛋白表达变化：与假手术组比较，模型组p-AMPK蛋白表达无显著变化（P>0.05）；与模型组比较，各给药组显著增加p-AMPK表达水平（P<0.05，P<0.01）。各组AMPK蛋白表达水平未见显著差异（P>0.05）。与假手术组比较，模型组PPARα和PGC-1α蛋白表达量明显降低（P<0.01）；与模型组比较，QLQX-M、QLQX-H组及卡托普利组二者蛋白表达显著上调（P<0.01）。4芪苈强心胶囊改善离体衰竭心脏能量代谢的机制研究各组左心室压力及心脏负荷的变化：采用低钙K-H液灌注复制心衰模型后，各组左心室压力明显降低，同时心脏负荷增加；与模型组比较，给予芪苈强心干预后，芪苈强心各剂量组左心室压力均有升高，且随着浓度的增加左心室压力升高幅度也增加，其中QLQX-0.2、QLQX-0.4浓度组左心室压力显著升高（P<0.01），有一定的量效关系。给予药物干预后，各浓度组左心室负荷也有不同程度的降低；各组给药前后自身比较：与低钙灌注致心衰状态时比较，给予药物治疗后芪苈强心各浓度组随着剂量的增加左心室压力升高幅度也增加（P<0.01），QLQX-0.1、QLQX-0.2、QLQX-0.4组和阳性对照药组显著降低左室负荷幅度（P<0.05，P<0.01）。给予阻断剂后左室压力及负荷变化：与给药时压力比较，加入两组阻断剂后压力均显著降低（P<0.01），心脏负荷均有所提高，其中加入阻断剂MK-886后心脏负荷升高明显（P<0.05）。各组离体灌注心脏冠脉流出量变化：与正常K-H液灌注组比较，模型组冠脉流量明显降低（P<0.01）；与模型组比较，QLQX-0.05和QLQX-0.1组、阳性对照组冠脉流量显著增加（P<0.05，P<0.01）。与QLQX-0.2组比较，两阻断剂组的冠脉流量均降低，无统计学差异。各组大鼠心肌组织中总腺苷酸池及能荷值的变化：与正常K-H液灌注组比较，模型组总腺苷酸含量降低，尚无统计学意义，模型组心肌组织能荷值显著降低（P<0.01）；与模型组比较，QLQX-0.05和QLQX-0.4组显著增加总腺苷酸池含量（P<0.05）；与模型组比较，QLQX-0.1、QLQX-0.2、 QLQX-0.4组及阳性对照组显著增加心肌组织能荷值（P<0.01）。心肌组织α-MHC、β-MHC、Drp1、Mfn2mRNA的表达：与正常K-H液灌注组比较，模型组心肌组织α-MHC、Mfn2mRNA显著下调（P<0.01），而β-MHC、Drp1mRNA表达明显增高（P<0.01）。与模型组比较，QLQX-0.1、QLQX-0.2和QLQX-0.4组增加α-MHC mRNA表达（P<0.01）；与QLQX-0.2组比较，两组阻断剂均降低α-MHC mRNA表达。与模型组比较，QLQX-0.2和QLQX-0.4组显著降低β-MHC表达量（P<0.01），与QLQX-0.2组比较，两组阻断剂增加β-MHC mRNA表达。与模型组比较，QLQX-0.4组显著降低Drp1mRNA表达量（P<0.05），QLQX-0.1、QLQX-0.2和QLQX-0.4组显著增加Mfn2表达量（P<0.05，P<0.01）。离体心脏p-AMPK、PPARα、p-PI-3K、p-Akt蛋白表达：与正常组K-H液灌注组比较，模型组p-AMPK、PPARα、p-PI-3K、p-Akt蛋白表达显著下调（P<0.01）；与模型组比较，各给药组显著上调p-AMPK蛋白表达（P<0.01）；与QLQX-0.4组比较，Compound C组p-AMPK表达明显下调（P<0.05）。与模型组比较，QLQX-0.2、QLQX-0.4组和阳性药组显著上调PPARα蛋白表达（P<0.01）；与QLQX-0.2组比较，两阻断剂组p-AMPK、PPARα均明显下调（P<0.05）。与模型组比较，各给药组p-PI-3K、p-Akt蛋白表达水平明显上调（P<0.05，P<0.01）；与QLQX-0.2组比较，两阻断剂组p-PI-3K、p-Akt蛋白表达量未见显著变化（P>0.05）；与阳性药组比较，QLQX-0.4剂量组显著增加p-Akt的蛋白表达（P<0.05）。结论:1首次以脉络学说营卫理论为指导，探讨微血管损伤在心力衰竭发病中的重要作用，脉络学说认为微血管损伤是心力衰竭重要的发病因素之一，血液动力学和神经体液调节异常共同参与，导致心肌组织结构功能损伤引发心室重构和代谢重构的复杂病理过程。通过实验研究探讨了在心衰时微血管损伤、能量代谢异常和心室重构的病理改变以及三者间的内在联系，验证了脉络学说营卫“由络以通、交会生化”理论科学价值，为从微血管病变切入探讨心力衰竭防治研究提供了新的思路。2通过整体动物实验，初步揭示了芪苈强心胶囊对心衰微血管损伤、心室重构、能量代谢的干预作用。采用胸主动脉缩窄术建立压力超负荷大鼠模型，证实芪苈强心胶囊通过调节血管活性物质、抑制炎症损伤，促进心肌微血管新生和结构保护、改善血流动力，抑制神经体液过度激活等多重作用，从而有效改善心功能。芪苈强心胶囊抑制心肌成纤维细胞增生，同时减少心肌细胞凋亡，其机制可能与CT-1及CytC介导的线粒体凋亡途径有关。芪苈强心胶囊芪苈强心胶囊通过p-AMPK/PPARα通路调节糖脂代谢途径，改善慢性心衰大鼠能量代谢；通过上调PGC-1α的表达保护心力衰竭大鼠心肌组织线粒体功能与氧化呼吸活性；同时降低循环血中LA、FFA以及UA浓度，减少对内皮损伤作用。3通过离体实验研究，进一步揭示芪苈强心胶囊改善心肌能量代谢的作用机制与p-AMPK/PPARα信号通路有关；证实芪苈强心胶囊通过上调Mfn2、下调Drp1mRNA保护心肌线粒体，同时芪苈强心胶囊下调Drp1mRNA的表达可抑制CytC介导的心肌细胞凋亡途径，说明能量代谢之线粒体与衰竭心脏的结构重构具有相关性。