研究背景双酚A（bisphenol A,BPA）属于环境内分泌干扰物,广泛分布存在于自然环境、动物和人类体液中,可通过饮食、呼吸等途径进入生物体内并产生一系列生物学效应。大量的研究数据表明,BPA对生物体的免疫、呼吸等系统具有不良影响,在雄性生殖系统主要表现为生殖器发育不良以及精液质量的下降。目前对于BPA致雄性生殖毒性作用的机制所有一定的研究,但总体仍不是清楚。细胞内线粒体和内质网在维持细胞正常生理功能起重要作用,而众多的研究发现,环境污染物能够造成内质网和线粒体损伤,二者的结构与功能的异常进一步导致细胞功能异常和产生毒性效应。我们前期研究发现BPA能够导致生殖细胞氧化应激,并引发线粒体和内质网损伤,提示线粒体和内质网结构以及功能异常可能在BPA致雄性生殖系统损伤中发挥重要作用,但是相关的效应和机制还不清楚。为此,我们通过建立BPA暴露致小鼠精母细胞损伤和性成熟小鼠生殖毒性体内外模型,评价其毒性效应,探讨BPA暴露对内质网和线粒体结构和功能的损伤效应并初步探索其作用机制。研究内容1、建立BPA致小鼠雄性生殖毒性动物模型。染毒5周后评价BPA暴露对小鼠精液质量、睾丸组织形态的影响。2、建立BPA染毒GC-2细胞模型。观察GC-2细胞形态,MST结合EdU分析GC-2细胞活力及增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,DCFH-DA探针结合流式细胞术检测细胞内活性氧;JC-1染色结合流式细胞术评价线粒体结构变化;Fluo4 AM染色检测细胞内Ca²⁺水平,内质网染色试剂盒结合电镜评价细胞内质网形态变化。3、基于建立的动物以及细胞模型,分析BPA暴露对细胞以及睾丸组织线粒体通路相关分子及内质网通路相关分子表达的影响。研究结果1、BPA染毒5周后,小鼠体重以及附睾指数无明显变化,300mg/kg/d BPA暴露组睾丸脏器指数下降;30mg/kg/d及300mg/kg/d染毒组快速运动精子百分率明显低于正常对照组而慢速运动精子百分率明显高于正常对照组。上述结果表明,BPA暴露使小鼠精液质量明显下降。2、观察了BPA染毒5周后小鼠睾丸组织的形态学变化,结果发现:各染毒组睾丸组织分别出现了不同程度的病理改变,其中300mg/kg/d高剂量病变最明显,管腔内各级生精细胞排列紊乱且严重缺失,精子数明显减少,曲细精管空泡化严重;TUNEL染色发现各BPA染毒组小鼠睾丸组织各级生精细胞凋亡。3、GC-2细胞暴露于20μM,40μM,80μM BPA后,细胞内ROS堆积;抗氧化剂NAC预处理后,细胞增殖抑制被部分逆转。表明ROS可能参与BPA抑制GC-2细胞活力的调控。4、GC-2细胞暴露于20μM,40μM,80μM BPA作用48h后,细胞线粒体膜电位下降;线粒体通路相关分子caspase3、caspase9、bcl2、bax和bad等表达异常,线粒体相关分子cyt-c从线粒体到胞质的释放,以及核转录因子AIF从线粒体到核的转移。BPA染毒动物睾丸组织中线粒体通路相关分子也被激活。这些结果表明:BPA暴露损伤线粒体,线粒体通路被激活,并在BPA致雄性生殖毒性中发挥作用。5、GC-2细胞暴露于20μM,40μM,80μM BPA作用48h后,细胞内质网数目结构异常,细胞内Ca²⁺浓度下降;内质网应激标志分子GRP78和Caspase12被激活;内质网通路相关分子PERK、p-PERK、EIF2α、p-EIF2α、chop和ATF6被激活,BPA染毒体内模型也证实了这一结果;抗氧化剂预处理可部分逆转BPA暴露引起的GC-2细胞中内质网通路的激活;这些结果提示,内质网也是BPA致雄性生殖系统损伤的靶细胞器,BPA暴露可引起内质网通路激活,ROS调控的内质网通路可能在BPA致雄性生殖毒性中发挥作用。结论BPA暴露可在体外诱导生精细胞和体内诱导雄性生殖毒性,引起生精细胞凋亡及精子活力下降。内质网和线粒体是BPA染毒损伤的靶细胞器。BPA暴露下,线粒体和内质网应激相关通路蛋白表达异常。抗氧化剂可通过对内质网通路相关分子的调控部分逆转BPA染毒引起的细胞毒性。ROS调控的线粒体通路和内质网通路可能在BPA致雄性生殖毒性中发挥重要调控作用。