研究背景肝脏是人体内重要的器官,具有代谢、合成、储存等多种生理功能,并且具有强大的再生功能。由于其独特的功能,肝脏易受药物、毒素、酒精、化学物质等造成的损害,引起功能障碍和再生能力丧失。目前各种急慢性肝脏疾病已是影响人类健康的重要原因之一,特别是终末期肝疾病尚缺乏有效地治疗手段。间充质干细胞是一类来源广泛的成体干细胞,能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等,并且具有自我更新的潜能。目前间充质干细胞被广泛应用于肝脏、肺、肾脏等多种组织损伤和移植物抗宿主病等多种疾病的治疗,其作用机制可能包括转分化、免疫调节和免疫抑制、抑制炎症、分泌细胞因子等。间充质干细胞向损伤部位的靶向迁移对其发挥作用非常重要,因此提高细胞移植后损伤部位间充质干细胞的数量是提高治疗效果的重要手段。连接黏附分子A是脊柱动物细胞中高度保守的一类连接分子,其独特的跨膜结构使其能够发生同源二聚化,参与紧密连接的形成,另外还具有调节细胞增殖、迁移、信号传导的功能。前期研究发现,通过上调间充质干细胞的连接粘附分子JAM-A表达,可促进间充质干细胞定向迁移到发育不成熟的毛囊组织,参与毛囊结构的重建,增强裸鼠的毛发再生。基于以上研究,我们通过分离、鉴定、扩增间充质干细胞,利用病毒载体构建连接黏附分子过表达的间充质干细胞,研究JAM-A在促进MSC修复CC14肝损伤中的作用及其机制。第一部分人早胚间充质干细胞的分离、鉴定与培养研究目的：利用间充质干细胞贴壁生长的特性,从早期流产胚胎中分离出间充质干细胞,进行鉴定,并进行传代培养和扩增,为后续进一步研究奠定基础。研究方法：利用贴壁培养方法获取原代间充质干细胞,通过形态学、免疫荧光和流式细胞术检测细胞表面阳性和阴性的细胞标志以及分化潜能,对细胞进行鉴定,并进行传代培养。研究结果：贴壁培养法可获得间充质干细胞,细胞形态呈纺锤形成纤维细胞状,流式细胞术检测细胞均阳性表达CD29(82.89±2.35%)、CD44 (91.95±1.11%)、CD90(92.90±0.97%),造血谱系特异性标志CD34和CD45的阳性率均小于1%,分别为(0.65±0.21%)和(0.77±0.14%),免疫荧光结果显示：MSC阳性表达表达CD29、CD44、 CD105。第二部分连接黏附分子JAM-A过表达系统的构建研究目的：利用病毒载体构建JAM-A过表达的MSC系统研究方法：利用cDNA文库获取目的基因JAM-A,并进行扩增,利用pGC-FU慢病毒载体构建重组质粒。再将重组载体转染至293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度。选择合适条件进行MSC的病毒感染,并检测JAM-A蛋白的表达。研究结果：重组质粒测序结果正确,病毒滴度>2.00E+7 TU/ml,在MOI值为50时可获得理想的感染效率,细胞感染率均在90%以上。重组质粒在感染MSC后稳定表达,WB结果显示JAM-AOV-MSC组JAM-A蛋白表达水平较MSC组显著升高。第三部分JAM-A在促进MSC修复CCl4肝损伤中的作用及其机制研究目的：研究JAM-A在促进MSC修复肝损伤中的作用,并探讨其可能机制。研究方法：制备CCl4诱发小鼠肝损伤,使用CD-DiI标记MSC,通过腹腔注射方式进行间充质干细胞移植,检测小鼠肝脏形态学、血清ALT、AST水平等肝损伤指标,利用免疫组织化学和免疫组织荧光技术检测肝脏JAM-A的表达和分布和肝损伤时炎症细胞浸润,在体外进行细胞粘附实验观察JAM-A对细胞粘附能力的影响,并观察JAM-A对MSC分泌作用的影响。研究结论：CM-Dil可安全稳定的标记MSC;JAM-A过表达可促进MSC对肝损伤的保护作用：降低血清ALT、AST水平、减少细胞坏死、减少炎症细胞浸润；肝损伤后JAM-A在血管内皮的表达增加；JAM-A可增强MSC的粘附能力,促进MSC抑炎因子分泌作用。