【摘 要】
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目的有机阴离子转运多肽1B3（Organic Anion Transporting Polypeptide,OATP1B3）属于人体有机阴离子转运多肽家族的成员之一,其主要分布于肝细胞基底侧,是重要的跨膜摄取转运体。OATP1B3的表达水平和功能不仅与药物在肝细胞内的摄取、分布有关,与多种疾病的发生发展都有关系。本研究旨在研究OATP1B3编码基因SLCO1B3的基因调控机制,进一步检测OATP1
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目的有机阴离子转运多肽1B3（Organic Anion Transporting Polypeptide,OATP1B3）属于人体有机阴离子转运多肽家族的成员之一,其主要分布于肝细胞基底侧,是重要的跨膜摄取转运体。OATP1B3的表达水平和功能不仅与药物在肝细胞内的摄取、分布有关,与多种疾病的发生发展都有关系。本研究旨在研究OATP1B3编码基因SLCO1B3的基因调控机制,进一步检测OATP1B3蛋白转运功能,为深入了解肝脏转运体对药物的摄取和分布,保证临床用药的有效性和安全性提供实验依据。方法我们首先构建SLCO1B3基因启动子全长及各分段报告基因重组载体,通过双荧光素酶报告实验分析出SLCO1B3基因启动子的关键活性区域;然后通过生物信息学技术预测潜在的转录因子结合位点;通过双荧光素酶报告基因实验、EMSA、Ch IP实验验证转录因子与SLCO1B3基因启动子结合位点的特异结合;通过构建转录因子的过表达载体,化学合成siRNAs沉默基因表达,用Western blot和realtime RT-PCR实验检测了SLCO1B3的m RNA水平和蛋白表达水平,验证转录因子整体水平对SLCO1B3/OATP1B3的影响。在确定c-jun调控SLCO1B3的转录表达后,由于c-jun需要被磷酸化激活才能发挥其调控作用,我们进一步用过表达载体,磷酸化激活剂和抑制剂处理细胞,Western blot检测c-jun,p-cjun和OATP1B3蛋白的表达水平。布洛芬被报道可以促进c-jun磷酸化,我们进一步用布洛芬处理细胞,研究布洛芬是否可以通过促进c-jun磷酸化调控OATP1B3蛋白的表达,进而影响OATP1B3摄取转运功能（以OATP1B3特异底物头孢氨苄为检测对象）。使用CCK-8法检测布洛芬和头孢氨苄对HepG2和Huh7细胞的半数抑制浓度(IC50),根据布洛芬和头孢氨苄IC50和临床正常用药量,选取合适浓度的布洛芬和/或头孢氨苄处理细胞,通过Western blot方法检测OATP1B3蛋白的表达,进一步用高效液相色谱-质谱联用技术检测细胞OATP1B3的摄取功能。结果1、双荧光素酶报告基因实验确定了SLCO1B3基因启动子的关键区域-198nt～+40nt。2、生物信息学分析预测-198nt～+40nt区域存在c-jun和HNF1α特异性结合位点。3、EMSA实验证实了转录因子c-jun可在体外特异结合于SLCO1B3基因启动子特定识别序列,HNF1α在体外不能特异结合SLCO1B3启动子特定识别序列。4、ChIP实验证实了c-jun可以与SLCO1B3基因启动子特定序列存在体内相互作用,而HNF1α未检测到与SLCO1B3启动子特定序列在体内的相互作用。5、双荧光素酶报告基因实验证实过表达c-jun使SLCO1B3基因启动子活性增加;相反地,沉默内源性c-jun使SLCO1B3基因启动子活性下降。6、Realtime RT-PCR及Western blot实验证实过表达c-jun使SLCO1B3基因m RNA水平增高,OATP1B3蛋白表达上调;相反地,沉默内源性c-jun使SLCO1B3基因mRNA水平下降,OATP1B3蛋白表达下调。c-jun磷酸化增加可显著上调OATP1B3蛋白表达水平。7、高效液相色谱-质谱联用实验证实布洛芬可促进细胞内c-jun磷酸化,增加OATP1B3蛋白表达,使细胞对OATP1B3特异底物头孢氨苄的摄取增加。结论1、通过构建SLCO1B3基因启动子全长及各分段报告基因重组载体,证实了SLCO1B3启动子-198nt～+40nt是启动子调控的关键区域。2、转录因子c-jun可以与SLCO1B3启动子-198nt～+40nt区域的特定结合序列在体内外特异结合,c-jun磷酸化可显著上调OATP1B3蛋白表达水平,增强OATP1B3的转运功能。
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