【摘 要】
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背景牙周病的治疗、错牙合畸形的正畸治疗、牙列缺失的种植治疗等多种口腔治疗过程中都涉及到了牙槽骨的破坏和修复重建,破骨细胞和成骨细胞之间的平衡对这一过程起着重要的作用,而促进牙槽骨中成骨细胞活跃在骨重建中起着至关重要的作用,人牙周膜干细胞（human Periodontal Ligament Cells,hPDLSCs）常被作为种子细胞用于研究口腔疾病治疗。大量研究表明Wnt信号通路与成骨过程密切相
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背景牙周病的治疗、错牙合畸形的正畸治疗、牙列缺失的种植治疗等多种口腔治疗过程中都涉及到了牙槽骨的破坏和修复重建,破骨细胞和成骨细胞之间的平衡对这一过程起着重要的作用,而促进牙槽骨中成骨细胞活跃在骨重建中起着至关重要的作用,人牙周膜干细胞（human Periodontal Ligament Cells,hPDLSCs）常被作为种子细胞用于研究口腔疾病治疗。大量研究表明Wnt信号通路与成骨过程密切相关,但是信号通路中具体哪些Wnt配体与人牙周膜干细胞的成骨功能相关,及其发生作用的分子机制目前尚未明确。目的本课题的研究旨在探索哪些Wnt配体与hPDLSCs成骨分化密切相关,并探究其具体影响。以期为牙周病、错牙合畸形、牙列缺失等多种口腔疾病的治疗提供实验基础和新的思路。方法1、采用酶消化联合组织块法分离培养hPDLSCs,通过免疫组化法确定细胞来源。运用茜素红染色鉴定成骨、油红O染色鉴定成脂、阿尔新蓝染色鉴定成软骨能力来检测hPDLSCs多向分化的能力。2、通过诱导hPDLSCs成骨分化,分别在诱导后7、10、14 d提取实验组与正常培养组的细胞总RNA,通过Real-time PCR分析Wnt信号通路的表达情况,筛选表达差异明显的基因,得到在hPDLSCs成骨过程中表达差异明显的Wnt配体:WNT3A和WNT4。3、通过慢病毒抑制筛选出的目的基因的表达,Real-time PCR及Western blot验证抑制效果后进行诱导成骨,在诱导第7 d进行碱性磷酸酶定性染色和定量分析,在诱导第14 d进行茜素红染色和氯化十六烷基吡啶萃取钙结节定量分析,并且提取诱导14 d的实验组和对照组的RNA,通过Real-time PCR分析二者成骨相关基因的表达差异,从而验证所筛选基因对hPDLSCs成骨分化能力的影响。4、配制WNT3A条件培养基和对照条件培养基,将hPDLSCs分别加入上述培养基中,通过CCK-8（Cell counting kit-8,细胞计数试剂盒8）检测细胞增殖情况。并用WNT3A条件培养基进行诱导成骨,检测WNT3A条件培养基与对照条件培养基诱导成果的差异,在诱导第7 d进行碱性磷酸酶定性染色和定量分析,在诱导第14 d进行茜素红染色和氯化十六烷基吡啶萃取钙结节定量;提取诱导14 d的实验组及对照组的RNA,检测成骨相关基因的表达量,验证加入外源性WNT3A蛋白后对hPDLSCs成骨分化的影响。结果1、成功分离培养出hPDLSCs,其形态为长梭形。免疫组化显示,细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白,为间充质来源,且具有多向分化潜能。2、Real-time PCR结果显示:WNT3A、WNT4在实验组中较正常培养组表达量上升。3、利用慢病毒感染抑制WNT3A、WNT4的表达:Real-time PCR及WB结果显示,经慢病毒感染后,细胞中WNT3A、WNT4的m RNA和蛋白表达水平均降低。抑制WNT3A或者WNT4后,诱导7 d后实验组碱性磷酸酶染色颜色较对照组浅,定量分析结果显示实验组碱性磷酸酶表达量较对照组低;诱导14 d茜素红染色后,实验组中红色不溶性钙盐较对照组明显减少;Real-time PCR结果显示,实验组成骨相关基因表达下降,hPDLSCs成骨分化能力较对照组下降。4、分别加入5%、10%的外源性WNT3A蛋白后,CCK-8检测加入WNT3A条件培养基实验组的OD值较对照组提高,差异有统计学意义,说明WNT3A条件培养基促进了hPDLSCs的增殖,成骨相关实验检测结果表明外源性WNT3A蛋白能抑制hPDLSCs的碱性磷酸酶表达,但是对其成骨分化能力没有明显的影响。结论WNT3A、WNT4在hPDLSCs诱导成骨组中高表达,抑制WNT3A、WNT4后hPDLSCs的成骨分化能力随之降低。加入外源性WNT3A蛋白后,促进了hPDLSCs的增殖能力,抑制了hPDLSCs碱性磷酸酶的表达,但是对其成骨分化能力没有明显影响。
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