甘蔗鞭黑粉病生防细菌筛选及功能基因的突变研究

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甘蔗鞭黑粉病菌是一种两型真菌,既有单倍体的单细胞菌体又有双核菌丝体,前者可长期营腐生生活,但不能侵入甘蔗;后者只生长在甘蔗活组织内,其形成必须经由两个具有亲和性的单倍体有性配合,抑制其配合将可达到控制病害之目的。本研究以干扰或阻止其有性配合为目标,对分自不同类型基质的细菌菌株进行筛选,获得了三株产生活性物质为酶类的革兰氏阴性细菌;对其中一个细菌菌株建立转座子Tn5插入诱导突变体系并获得了功能基因的部分序列,为进行该细菌开发利用提供了理论依据。主要研究结果如下: l、从华农校园内、华农附近农场和增城市郊等采集的27种不同基质中分离得到了2106个菌落性状不同的细菌菌株,采用建立的生防细菌筛选和有效活性物质测定体系,得到了3株对甘蔗鞭黑粉病菌有性配合具有较高的抑制活性,而不影响甘蔗鞭黑粉病菌单性系的正常生长,产生的活性物质不耐100~C热处理且能被蛋白酶K分解的革兰氏阴性细菌菌株,编号分别为DLBB32、GTSH28、YJHM58。 2、选取生防细菌YJHM58菌株作为研究对象,对其进行了单菌落形态特征观察、16SrDNA序列分析和BIOLOG细菌鉴定三个方面的研究。该菌株的16SrDNA序列在系统发育树中与Pseudomonasfluorescence菌株处于同一分支,菌株间的相似系数达到99%;BIOLOG系统的鉴定结果,YJHM58菌株与荧光假单胞菌(P.fluorescence)具有最大的相似性0.718,位距为4.28,可能性为99%。综合以上结果,确定YJHM58菌株为荧光假单胞菌(P.fluorescence)。 3、建立了生防细菌YJHM58菌株的转座子Tn5插入诱导突变体系,通过双亲本结合转移试验得到了生防细菌YJHM58菌株的稳定的、高结合频率的抗卡拉霉素和利福平的Tn5插入突变接合子3100多个的突变库。通过对得到的Tn5插入突变接合子进行的三轮定向筛选,获得了14个对甘蔗鞭黑粉病菌有性配合完全失去抑制作用的功能突变株。这些突变株的性状稳定,经过多次转接和对峙培养作用效果不变。 4、采用设计的特异性引物和随机简并引物,经过不同组合作TAIL-PCR后,得到了两个目的接合子的Tn5插入区侧翼序列片断。将PCR产物与pTA2载体连接后导入EcoliDH5a中,筛选阳性转化子用作测序。将测序结果用BLAST服务器比对分析,表明1419号接合子的Tn5插入区侧翼序列编码转醛醇酶,在细胞内糖代谢的磷酸戊糖途径的非氧化阶段中起着重要的作用,1697号接合子的Tn5插入区侧翼序列编码一个引发因子、肽酶S14、ClpP以及一个ATP依赖的Clp蛋白酶的水解蛋白的亚基,它们均与细菌蛋白质的转运以及分解代谢过程相关。
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