研究背景在多种情况下可以发生骨骼肌萎缩,比如废用、饥饿、衰老和糖尿病、肿瘤、艾滋病等疾病状态下[1]。前炎症因子TNF-α在骨骼肌萎缩的多种代谢过程中起着关键作用,如细胞生长、分化、炎症、凋亡和坏死。TNF-α的病理性升高被认为与骨骼肌的消耗密切相关[2]。已有研究证明至少有两条通路在TNF-α造成的骨骼肌萎缩中起作用：抑制成肌细胞myogenin的表达和促进成肌细胞或肌管的凋亡[3]。因此,TNF-α抑制成肌细胞的肌分化的过程并最终导致细胞凋亡,此过程在骨骼肌萎缩中有着重要影响。凋亡,是一个生理性的细胞死亡,可以清除发展中多余的组织,对成人期保证组织的稳态十分关键[4]。凋亡的最初阶段包括死亡诱导通路,包括氧自由基和形态氮的释放,死亡受体配体的表达使bcl-2家族蛋白的表达水平改变[5]。早期过后,核激活物,细胞表面受体和线粒体途径被激活,进而导致细胞死亡,伴随着特征性的细胞质和细胞核改变[6]。在这个阶段中,细胞中使蛋白分解的caspases在细胞质中被激活[5],并出现凋亡所致的特征性细胞变化(DNA片段化,核固缩,细胞收缩,质膜出泡等等)[7]。因此可以推断,具有改变bcl-2家族蛋白表达水平,阻断caspase表达和减少特征性凋亡形态学表现的治疗可能有抑制凋亡的作用。当归,被认为具有修复组织损伤的作用,其提取物的化学成分分为脂溶性成分和水溶性成分,其中脂溶性成分被认为是其主要的有效药理活性成分[8]。其中藁本内酯作为脂溶性成分的主要物质,被认为是最有研究潜力的活性成分[9]。已有研究表明藁本内酯在蛛网膜下腔出血模型中有神经保护作用,可以通过减少p53和剪切型caspase-3的表达减少凋亡损害。尽管研究中藁本内酯对于bax的表达没有影响,但抗凋亡蛋白-2的表达呈现了剂量依赖性升高的表现,最终使bcl-2/bax的比值改变发挥抗凋亡作用[10]。同时,还有研究深入探索藁本内酯的抗凋亡作用,是主要通bcl过升高bcl-2、下调bax、caspase-3来抗凋亡来实现的[11]。因此,调节bcl-2家族蛋白和caspases的表达水平被认为是藁本内酯抗凋亡的主要机制。由于藁本内酯对于肌肉细胞中抗凋亡的机制未明,本研究旨在探索藁本内酯对C2C12细胞分化过程中由TNF-α导致的凋亡的保护作用。研究目的本研究旨在探索藁本内酯可以抑制C2C12细胞分化过程中由TNF-α导致的凋亡,并阐述其部分可能机制。方法1.细胞培养C2C12细胞购自社科院细胞库。C2C12细胞在37℃孵育箱中使用生长培养基培养。2.藁本内酯毒性检测在96孔板中接种C2C12成肌细胞,24小时后进行药物干预,培养液中药物浓度为1,5,10,20,30,40,50μM,对照组细胞培养液为生长培养基,药物干预24小时和48小时后进行细胞活力检测。3.实验模型细胞在孵育箱中培养,当细胞密度到达60～70%时,将生长培养基换为分化培养基诱导成肌细胞分化成为肌管,培养液每48小时换一次。4.分组干预各组干预条件如下：正常对照组细胞培养于分化培养基；DMSO对照组细胞培养于含有1%DMSO的分化培养基中；TNF-α对照组细胞和藁本内酯干预组均在溶解了20ng/mL TNF-α的分化培养基中干预；藁本内酯干预组的细胞使用含有不同浓度藁本内酯的分化培养基干预。5.凋亡检测5.1Hoechst33342染色检测细胞接种于12孔板上,按上述方法干预。以6μg/mL Hoechst33342为DNA荧光染料染色,细胞核DNA可被染色后立即于光学显微镜下观察。实验使用凋亡指数(AI)米定量凋亡数量,AI为凋亡细胞占总细胞数的比值。5.2DNA片段检测在上述干预之后,细胞总DNA用DNA提取试剂盒提取,提取的总DNA在2%琼脂糖电泳中分离,琼脂糖使用EB染色,最后在UV下观察检测。6.蛋白免疫印迹使用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品,分离后的凝胶转膜至PVDF膜。转膜后,PVDF膜在封闭液中封闭,封闭后用TBST清洗3次,将膜放置于一抗中孵育,一抗孵育结束后TBST清洗膜3次,接着放于相应的二抗中孵育,二抗孵育结束后TBST清洗膜3次。孵育抗体后的PVDF膜在成像系统中运用显影液曝光并检测蛋白条带。7.肌管形态学检测肌管使用HE染色后在放大200倍的显微镜下检测其形态。各组干预方法如上所述,培养液每48小时换一次。8.统计学分析使用SPSS13.0进行统计学分析。由于干预时间和干预方法对于实验结果均有影响,本实验使用单变量多因素方差分析检测,数据检测结果根据其方差齐性检验结果进一步使用Bonferroni检验或Dunnett’s T3检验来进行组间比较。对于单变量单因素的方差分析使用单因素方差分析,然后根据其方差齐性检测结果,使用Bonferroni检验或Dunnett’s T3检验来进行组间比较。p<0.05被认为为有统计学意义。结果1.藁本内酯对于C2C12细胞的毒性作用用MTT检测细胞活力,干预细胞药物浓度为1到50μM,干预时间点为24小时和48小时。检测结果表明两个孵育时间点浓度在10μM及10gM以上浓度的藁本内酯对细胞生长均有明显的抑制作用,两个孵育时间点之间差异没有统计学意义。2.藁本内酯抑制C2C12细胞分化过程中TNF-α导致的凋亡2.1Hoechst33342染色检测根据细胞活力检测结果和预实验结果,将实验分组分为6组,包括正常对照组、DMSO对照组、TNF-α对照组和藁本内酯治疗组(1μM,5μM,10μM)。按上述干预方法干预96小时后用Hoechst33342染色,观察各组细胞染色后形态。TNF-α对照组表现出凋亡形态学表现的细胞数量高于比其他组,藁本内酯治疗组的凋亡细胞数量较TNF-α对照组少,并呈现一种量效关系。根据AI值的结果,DMSO对照组与正常对照组之间的差异无统计学意义,TNF-α对照组AI值相比正常组和DMSO对照组显著升高。藁本内酯治疗组相比TNF-α对照组AI较低,其中以浓度10μM效果最为显著。同时,干预时间也影响AI的值,干预24小时、48小时的细胞与干预72小时、96小时之间的差异有统计学意义,而干预24小时和48小时之间的差异没有统计学意义。2.2DNA片段检测基于上述结果,在以下实验中将实验组分为5组,即正常对照组、TNF-α对照组和藁本内酯治疗组(1μM,5μM,10μM),干预时间选择48小时和96小时。实验提取各组样品总DNA并检测DNA片段化的情况以验证藁本内酯的抗凋亡作用,提取的样品总DNA在琼脂糖凝胶中电泳,电泳后使用EB染色后检测。分析DNA片段的条带的结果显示,TNF-α对照组相比正常组的DNA片段显著增多。藁本内酯治疗组(1μM,5μM,10μM)相比TNF-α对照组DNA片段有所下降,其中以浓度10μM的藁本内酯治疗组下降的最为明显。3.凋亡相关蛋白表达检测检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、 pro-caspase-8, pro-caspase-3的表达。通过分析蛋白条带的结果后,总体上,藁本内酯通过上调bcl-2/bax比值、pro-caspase-3和pro-caspase-8的表达水平来发挥其抗凋亡作用,其作用呈现量效关系。TNF-α对照组相比正常组来说,bcl-2/bax比值、pro-caspase-3和pro-caspase-8的表达水平均下降,而藁本内酯治疗组相比TNF-α对照组的表达量有所上调。4.磷酸化Akt的表达水平检测藁本内酯上调磷酸化Akt的表达水平,而相较于正常组,TNF-α对照组磷酸化Akt表达量下降。在两个干预时间点,TNF-α对照组和藁本内酯治疗组的Akt表达水平均低于正常组,其表达量之间的差异有统计学意义。TNF-α对照组和藁本内酯治疗组之间相比,干预48小时后,藁本内酯治疗组(5μM和10gM)比TNF-α对照组的磷酸化Akt的表达水平显著提高。干预96小时后,藁本内酯治疗组(1μM和10μM)相比TNF-α对照组的磷酸化Akt的表达水平也有显著上调。5.肌管形态学观察和相关指标检测C2C12细胞在干预96小时后使用HE染色,观察其形态。TNF-α对照组和藁本内酯治疗组相比与正常组均抑制了肌管的形成,正常组肌管数量明显超过比其他各组,而藁本内酯组的细胞形成的肌管较少并大部分为成肌细胞。同时,实验检测了蛋白myogenin表达水平。正常组的myogenin蛋白表达水平高于其他各组,其之间的差异有统计学意义,同时,藁本内酯治疗组myogenin蛋白表达水平相比于TNF-α对照组显著下降。结论在本实验中,我们探索了藁本内酯对C2C12细胞分化过程中由TNF-α导致的凋亡有抗凋亡的作用。藁本内酯通过改变bcl-2/bax比值,上调抗凋亡蛋白bcl-2、pro-caspases-3、pro-caspases-8的表达水平,并同时抑制caspase-3和8的激活,激活Akt信号通路,使细胞增殖抑制细胞凋亡。