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真菌免疫调节蛋白(Fungal Immunomodulatory Proteins,FIPs)是一类具有生物活性的小分子蛋白质,已证实具有免疫调节活性、抗肿瘤作用、促进淋巴细胞增殖、血红细胞凝集以及诱导免疫细胞分泌细胞因子等作用。本实验室通过基因改组技术,分别利用FIP-glu和FIP-gsi以及FIP-glu、FIP-fve和FIP-vvo获得了新的重组FIP基因——FIP-SN15和FIP-SJ。本研究以此为基础,构建原核表达载体pET-30a::FIP-SN15和pET-30a::FIP-SJ,并转化原核表达大肠杆菌宿主细胞BL21。通过IPTG诱导表达,获得重组真菌免疫调节蛋白FIP-SN15和FIP-SJ。本研究结合Ni-NTA螯合柱、超滤管以及葡聚糖Sephadex G-75凝胶柱对携带有His-tag的重组蛋白FIP-SN15和FIP-SJ进行纯化。将纯化后的蛋白FIP-SN15和FIP-SJ处理小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7,通过qRT-PCR研究其对巨噬细胞的免疫调节作用。结果表明,SDS-PAGE和Western blotting实验显示大肠杆菌BL21成功表达了重组蛋白FIP-SN15和FIP-SJ;由SDS-PAGE和Western blotting检测结果可知,FIP-SN15经0.5 mM IPTG诱导5小时后其表达量达最高,结合BandScan V5计算,表达量约为35.31 mg/L;FIP-SJ经0.5 mM IPTG诱导后则形成包涵体;蛋白纯化试验显示,利用Ni-NTA柱纯化蛋白时,含25 mM咪唑(imidazole)的洗脱液可以很好地除去杂蛋白,含有250 mM imidazole的洗脱液可以用于纯化携带有His-tag的FIP-SN15并且无明显杂质;葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱层析纯化蛋白实验得到了洗脱曲线,在洗脱峰处蛋白浓度最高,在约1/3柱体积的洗脱液中可获得纯度相对较高的FIP-SN15。利用2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L和16 mg/L的rFIP-SN15处理小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7后发现,与PBS对照组相比,在转录水平上肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)的表达量均有增加并呈现一定的剂量关系,且在4 mg/L时TNF-α的表达量为PBS组的约5倍,达到最高;通过对TNF-α合成通路上相关基因如蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)以及I型精氨酸酶(arginase 1,ARG1)的mRNA相对表达量的检测,发现ARG1和mTOR的mRNA表达水平上调显著(p<0.05),并且Akt的mRNA表达水平上调极其显著(p<0.01)。结果表明,rFIP-SN15直接或者间接通过对Akt、ARG1和mTOR的调控增加TNF-α的转录,从而起到免疫调节作用。本研究对属内重组FIP进行了体外重组表达、纯化以及功能研究,这是首次对FIP突变体进行的研究;此外,通过对TNF-α合成途径的部分相关基因的表达水平研究,初步探究了rFIP-SN15对巨噬细胞诱导TNF-α发挥免疫调节作用的机制。