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第一章血浆游离DNA定量检测在食管鳞癌诊断中的意义背景和目的：食管癌是我国常见恶性肿瘤之一,其中河南林州为世界最高发地区。我国食管癌病理类型以鳞癌多见,占90%以上。上消化道内窥镜是目前食管癌诊断及疗效监测的主要手段。与肝癌、肠癌、卵巢癌等常见肿瘤相比,食管癌的诊断和监测尚缺乏相对有效的肿瘤标志物。循环游离)NA(circulating cell-free DNA,cfDNA),是指血清或血浆中游离于细胞外的DNA片段。已有研究显示,对循环游离DNA进行定量检测有潜在的肿瘤标志物作用。但这些研究研究数据相差较大,对食管鳞癌的研究也并不多见。本研究的目的是对血浆游离DNA定量检测在鉴别食管鳞癌与健康人的能力进行研究,探讨血浆游离DNA定量检测在食管鳞癌诊断中的潜在临床应用价值。方法：对60例健康人、49例食管鳞癌患者的血浆标本提取并纯化血浆游离DNA,应用实时荧光定量PCR(SYBR Green Ⅰ)方法进行定量检测,分析健康人与食管鳞癌患者之间、不同临床病理特征食管鳞癌患者之间血浆游离DNA水平的差异,并通过ROC曲线对血浆游离DNA水平诊断食管鳞癌的能力进行评价。结果：(1)60例健康人血浆游离DNA含量中位数为17.91ng/m1,四分位区间：12.99～29.90ng/ml。其中男性组血浆游离循环DNA水平中位数(19.10ng/m1)与女性组(17.17ng/m1)无显著差异(P=0.382)；≤60岁组(18.17ng/m1)与>60组(15.46ng/m1)亦无显著差异(P=0.374)。(2)49例食管鳞癌患者血浆游离DNA含量中位数为49.72ng/m1,四分位区间：28.17-68.42ng/m1。其中男性组血浆游离循环DNA中位数(51.14ng/m1)与女性组(38.26ng/m1)差异无统计学意义(P=0.382),≤60岁组(45.81ng/m1)与>60组(51.14ng/m1)差异亦无统计学意义(P=0.374)。(3)49名食管鳞癌患者血浆游离DNA中位数(49.72ng/m1)显著高于60名健康人(17.91ng/m1)(P=0.000)。血浆游离DNA水平测定鉴别健康人和食管鳞癌患者的ROC曲线下面积(AUC)为0.918(95%CI0.870-0.967),以血浆游离循环DNA浓度29.43ng/ml作为诊断食管鳞癌的临界值,其检测敏度为75.5%,特异度为93.3%,假阳性率6.7%,假阴性率24.5%,Youden指数0.708,诊断效果最好。(4)将49例食管鳞癌患者分别按照肿瘤生长部位、局部淋巴结浸润情况、组织病理学分级、TNM临床分期进行分组,其中：胸上段10例、胸中段29例、胸下段10例；局部淋巴结浸润(+)26例、局部淋巴结浸润(-)23例；高分化10例、中分化29例、低分化10例；Ⅰ/Ⅱ期30例、Ⅲ期19例。统计结果显示：Ⅲ期患者血浆游离DNA中位水平(67.92ng/m1)显著高于Ⅰ/Ⅱ期患者(33.42ng/m1)(P=0.000)；局部淋巴结浸润(+)患者血浆游离DNA中位水平(62.82ng/m1)显著高于局部淋巴结浸润(-)患者(33.90ng/ml)(P=0.007)；胸上段患者组(56.12ng/m1)、胸中段患者组(49.72ng/m1)、胸下段患者组(34.78ng/m1)之间及高分化患者组(33.41ng/m1)、中分化患者组(61.68ng/m1)、低分化患者组(61.68ng/m1)之间血浆游离DNA水平则无显著差异(P=0.248、P=0.094)。结论：本文的研究结果提示：(1)血浆游离DNA定量测定对鉴别食管鳞癌与健康人具有显著的意义,可为食管鳞癌的诊断提供一定的辅助信息,但没有足够的敏感性和特异性成为诊断食管鳞癌的独立标志物；(2)血浆游离DNA水平与食管鳞癌临床分期和局部淋巴结转移状况相关,可为食管鳞癌患者预后提供一定的线索。第二章食管鳞癌患者血浆游离DNA中COL14A1基因异常甲基化状态分析背景和目的：表观遗传学(epi genetics)是研究核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达发生可遗传变化的一门遗传学分支学科。表观遗传现象主要包括DNA甲基化(DNA methylation),基因组印记(genomic imprinting),组蛋白修饰(histone modification)等。其中DNA甲基化是最为重要,也是目前研究最为深入一种表观遗传学形式。DNA甲基化是指在DNA双螺旋中,DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMT)催化下,活性甲基被转移到特定碱基的过程。在哺乳动物中,DNA甲基化主要发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG)的第5位碳原子上,形成5’一甲基胞嘧啶(5-MethylCytosine)。众多研究表明,DNA甲基化在肿瘤发生发展过程中有重要作用,是肿瘤发生的早期事件之一,具有潜在的肿瘤标志物意义。COL14A1是一种存在于细胞外基质中与胶原纤维成熟相关的大分子糖蛋白。而细胞外基质成分的改变被认为与肿瘤进展和转移。COL14A1与核心蛋白聚糖关系密切,后者是一种小分子富亮氨酸蛋白聚糖,已经逐步被证明可强烈抑制多种肿瘤细胞生长,这种抑制作用可能由其核心蛋白与表皮生长因子受体和其他ErbB家族蛋白介导。在肾癌细胞系和原发性肾癌中曾检测到COL14A1基因启动子区域高甲基化状态,且高甲基化与基因沉默和mRNA下调相关联。本课题组前期的芯片筛选试验中,发现食管鳞癌组织中也存在COL14A1基因启动子区域高甲基化状态。本研究以前期高通量甲基化芯片筛选实验数据为基础,对我国食管鳞癌高发区食管鳞癌患者肿瘤组织及血浆游离DNA中COL14A1基因启动子区域甲基化状态进行检测分析,并探讨其在食管鳞癌诊断中的临床应用价值。方法：应用甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR, MS-PCR)技术对50例健康人血浆游离DNA、42例食管鳞癌患者血浆DNA及其配对的肿瘤组织、癌旁组织DNA中COL14A1基因启动子区域甲基化状态进行检测,分析健康人与食管鳞癌患者血浆游离DNA之间、食管鳞癌组织与配对的癌旁组织之间COL14A1基因启动子区域甲基化状态的差异。另外对食管鳞癌患者血浆与配对的肿瘤组织中COL14A1基因启动子区域甲基化状态的相关性进行分析,探讨血浆游离DNA能否可靠的反映肿瘤组织中的甲基化状态。结果：(1)42例食管鳞癌患者中,肿瘤组织DNA中COL14A1基因启动子区域甲基化阳性率为45.24%(19/42)显著高于其配对的42例癌旁组织(11.9%5/42)(χ2=11.43,P=0.001)。(2)肿瘤组织标本COL14A1基因启动子区域为非甲基化者,其配对的血浆游离DNA均为非甲基化。肿瘤组织标本COL14A1基因启动子区域甲基化者,其配对的血浆DNA多为甲基化,少有非甲基化。对肿瘤组织DNA与配对的血浆游离DNA中COL14A1基因启动子区域甲基化状态进行Spearman相关分析,Spearman相关系数为0.737(P<0.001)。(3)食管鳞癌患者血浆游离DNA中COL14A1基因启动子区域甲基化阳性率(30.95%13/42)显著高于正对照人群(0%0/50)(χ2=18.02,P=0.000)。(4)不同年龄、性别、肿瘤组织学分级及TNM临床分期亚组间,血浆游离DNA中COL14A1基因启动子区域甲基化阳性率均无显著性差异(P>0.05)。结论：本文的研究结果提示：(1)食管鳞癌患者肿瘤组织及血浆游离DNA中COL14A1基因启动子区域存在异常高甲基化状态,对食管鳞癌诊断具有潜在的临床应用价值；(2)血浆游离DNA较为准确可靠地反映肿瘤组织中COL14A1基因启动子区域甲基化状态,可为食管鳞癌的基础与临床研究提供标本源。