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研究背景与目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染在我国是肝细胞癌(HCC)的最主要致病原因。绝大部分HCC患者合并有HBV感染。HBV可促进肝细胞恶变及侵袭、转移。但是其作用机制尚不明确。乙肝病毒x基因(HBx)编码的HBx蛋白具有强大的恶性转化能力,可以诱导肝细胞癌的发生,并增加其恶性表型,导致肿瘤的预后不良。其中的一个机制为:HBx可以导致一些抑癌基因失活,从而使抑癌基因失去对细胞恶性表型转化和侵袭、转移能力的抑制作用。我所前期的研究结果以及文献报道均显示,HBx可促进癌基因c-Src蛋白的活化,但其机理尚不清楚。Caveolin-1作为一个候选抑癌基因,是c-Src蛋白活性调控的关键性抑制因子。推测其可能是上述过程中的一个重要中介因子。HBx是否对Caveolin-1有调控作用?通过查阅文献,我们收集到以下信息:第一,DNA甲基化是抑癌基因在恶性肿瘤中表达下调的一个重要分子机制;第二,已在多种肿瘤中发现Caveolin-1存在甲基化状态;第三,包括HBV在内的多种病毒可诱导抑癌基因发生启动子区域高甲基化,从而下调其表达。基于以上理论,我们得出假设:HBx有可能导致Caveolin-1启动子区域甲基化,抑制其转录活性,从而下调Caveolin-1表达。本文重点是验证上述假设,探讨HBx对Caveolin-1的调控及其分子机制。材料与方法:1.通过Real-Time PCR、免疫组化方法在123例临床肝细胞癌组织中检测Caveolin-1和HBx的表达,探讨它们之间以及与各临床病理因素间的关联;在不同侵袭、转移潜能的同系肝癌细胞株MHCC-97L和MHCC-97H中,检测其Caveolin-1表达,以明确其与侵袭、转移能力的关系;2.利用Adeasy系统,构建Caveolin-1重组腺病毒载体,用其转染HepG-2肝癌细胞,通过Western-blot、侵袭实验、运动实验等方法,观察过表达Caveolin-1对HCC活化型c-Src蛋白的表达调控作用,以及对其侵袭、运动能力的影响;3.用HBx重组腺病毒载体转染SMMC-7721肝癌细胞,观察HBx对Caveolin-1的调控作用;以巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)方法结合测序检测外源性HBx是否可引起Caveolin-1启动子区域CpG位点高甲基化,并在合并HBV感染的HCC组织中检测其Caveolin-1启动子甲基化情况;4.由于Caveolin-1启动子序列中含有2个转录因子SP1蛋白的特异性结合位点,而DNA甲基化可抑制SP1的转录激活作用。我们设计并构建一系列序贯缺失5’端SP1结合位点的Caveolin-1启动子报告质粒,使其分别包含完整Caveolin-1启动子序列、缺失一个SP1转录元件和缺失全部两个SP1转录元件。通过萤虫酶活性检测分析,以明确转染HBx基因对于Caveolin-1启动子转录活性的影响,并初步探讨SP1转录元件在其中所起的作用;5. DNA甲基化转移酶(DNMT)是DNA甲基化的主要催化酶。利用外源性转染HBx基因,检测SMMC-7721细胞总DNMT活性以及其中有转甲基活性的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA表达的变化,明确HBx对上述DNMT表达的影响;分别设计并构建DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的启动子报告质粒,检测并分析其萤虫酶活性,探讨HBx对上述基因启动子转录活性的影响。结果及结论:1.在临床HCC组织标本及不同侵袭、转移潜能的肝癌细胞中检测Caveolin-1及HBx表达,我们得出如下结果:1.1. Caveolin-1的表达在HBV相关性肝细胞癌中明显下调;1.2. Caveolin-1的表达与大/小肝癌、AFP表达水平、大血管侵袭、肿瘤单发或多发和pTNM分期等临床病理因素均呈显著负相关。提示Caveolin-1表达与HCC的进展有密切关系,其表达随着肿瘤的进展而下调;1.3.在同系中分离出的不同侵袭、转移潜能的细胞株中,高侵袭、转移潜能的肝癌细胞株MHCC-97H中Caveolin-1的表达明显低于低侵袭、转移潜能的MHCC-97L,提示了Caveolin-1的表达随着肿瘤侵袭、转移能力的增强而下调;1.4. Caveolin-1的表达与HBx表达水平呈显著负相关,暗示着可能存在HBx下调Caveolin-1基因表达的机制。2.成功构建了携带Caveolin-1基因的重组腺病毒载体,并能够高效转染HepG-2肝癌细胞,目的基因得到高表达;外源性转染Caveolin-1基因,可以抑制c-Src蛋白的活化,降低HepG-2肝癌细胞的侵袭、运动能力。3. HBx可以下调Caveolin-1基因的表达;33例HCC组织中84.8%(28/33)均存在Caveolin-1基因启动子区域部分甲基化,说明在合并HBV感染的HCC中,Caveolin-1基因启动子区域甲基化是一个普遍存在的现象;HBx可引起SMMC-7721肝癌细胞Caveolin-1基因启动子区域部分CpG位点甲基化;去甲基化药物5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-2’-dc)可恢复Caveolin-1基因的表达,说明DNA甲基化是HBx导致该基因表达下调的原因之一。4.成功构建了系列序贯缺失5’端SP1结合位点的Caveolin-1基因启动子报告质粒;HBx可以通过诱导Caveolin-1启动子区域甲基化,而降低其完整启动子的转录活性;转录因子SP1蛋白可能是Caveolin-1启动子转录活性的关键激活因子之一。HBx对Caveolin-1启动子转录活性的调控可能是通过阻碍转录因子SP1蛋白与DNA特异性结合而实现的。5. HBx可上调总DNMT的活性;成功构建了DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的启动子报告质粒;HBx可明显上调DNMT1和DNMT3a的启动子转录活性,其mRNA表达水平也随之升高;HBx对DNMT3b无显著影响。推测DNMT1和DNMT3a在HBx诱导Caveolin-1基因高甲基化的机制中可能起到主要的催化作用。综上所述,本研究主要结论如下:1. Caveolin-1基因在HBV相关性HCC中的表达与肿瘤的进展密切相关,其表达下调,暗示着肿瘤的预后不良;外源性转染Caveolin-1基因可抑制HCC的侵袭、运动能力。2. HBx蛋白可下调HCC中Caveolin-1的表达。其分子机制为:HBx蛋白从启动子层面上调了DNA甲基化转移酶DNMT1和DNMT3a活性,导致Caveolin-1基因启动子区域部分CpG位点甲基化,使其中的SP1转录激活元件失去增强调节作用,抑制其转录活性,从而使该基因的表达下调。