研究背景:动脉粥样硬化血栓形成(atherothrombosis)已成为心肌梗死、血栓性卒中、及周围血管疾病等多种临床疾病共同的基本病理过程。动脉粥样硬化作为一个慢性病理过程,在动脉粥样硬化形成早期可以无临床症状,而在慢性炎症等因素的刺激下,粥样斑块尤其是脆性斑块可发生斑块侵蚀或破裂并继发血小板的粘附、活化、聚积,致急性血栓的形成。而体内存在有天然的抗血小板活化、聚积的抑制物,这些抑制物在防止动脉粥样硬化及血栓形成过程中起着重要作用。前列环素(prostacyclin , PGI2)是花生四烯酸经环氧合酶(cyclooxygenase, COX)途径级联催化而生成的一种脂质介质。研究发现PGI2具有强大的扩血管作用和抗血小板聚积作用。PGI2与TXA2是迄今已知的具有调控血小板功能最强的一对内源性物质,PGI2与TXA2之间的平衡是维持正常血液内环境相对稳定的必要条件。目前升高血液中PGI2的水平已成为了临床上有效抗血栓治疗的靶点。环氧合酶则是花生四烯酸级联催化反应过程中的一个重要限速酶,主要有两个亚型:结构型(COX-1)和速生型(COX-2)。研究发现COX-2与动脉粥样硬化有着密切关系,在动脉粥样硬化斑块中COX-2的表达明显增高,而且斑块中COX-2/PGES过度表达与动脉粥样硬化斑块的不稳定性有关,但也有越来越多的证据表明COX-2并不完全对机体有害,它能促使炎症发生的同时也有着抗炎、抗纤维化及抗血栓等作用。高密度脂蛋白(high density lipoprotein , HDL)主要由脂质和载脂蛋白成分组成。当前,越来越多的研究显示HDL具有抗动脉粥样硬化和血管保护作用,血浆中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平与临床心血管事件风险性之间存在显著负相关,且研究还发现血浆中HDL-C的水平与血浆中PGI2稳定产物6-keto-PGF1的水平呈正相关。体外实验也得以证实HDL2及HDL3均能剂量依赖性诱导内皮细胞PGI2的释放,抑制COX-2活性后PGI2生成减少,且HDL中的磷脂成分,1-磷酸-鞘胺醇(Sphingosine-1-phosphate ,S1P),可通过细胞膜上的S1P受体介导的p38MAPK/CREB途径上调平滑肌细胞COX-2的表达与PGI2的释放。清道夫受体B类1型(Scavenger receptor class B type I,SR-B1)作为体内HDL的生理性相关受体,它可与HDL中apoA1进行特异性识别、结合,进而介导HDL抗炎、抗血栓、抗氧化、抗内皮损伤等作用。HDL与SR-B1受体结合后可经PI3K-Akt/MAPK途径活化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),增加NO的生成以及激活Rac,最终促使内皮细胞形成伪足、迁移,进而修复内皮损伤。第一部分SR-B1在HDL诱导内皮细胞PGI2释放中的作用目的:SR-B1做为HDL的生理性相关受体,它是否也在HDL诱导内皮细胞PGI2生成中发挥作用。故本实验的目的也就是观察SR-B1受体在HDL诱导内皮细胞PGI2释放过程中的作用。方法:1.不同浓度(30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml)apoA1处理ECV304细胞24小时;30μg/ml apoA1处理不同时间(3、6、12、24小时);30μg/ml apoA1及1μmol/L S1P处理内皮细胞24小时。2.转染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重组表达质粒48小时后,30μg/ml HDL孵育24小时。3.转染SR-B1 siRNA 48小时后,30μg/ml HDL孵育24小时。设空白组作对照,以30μg/ml HDL处理组为阳性对照,荧光显微镜下鉴定转染效率;RT-PCR和/(或)Western blot检测SR-B1 mRNA与蛋白的表达;ELISA法检测培养液中6-keto-PGF1的生成。结果:30μg/ml apoA1处理12小时可以使PGI2生成增加,且24小时达高峰;而浓度实验中发现在30μg/ml浓度时即可见PGI2生成增加,但随后PGI2生成并没有随apoA1浓度的增高而增加;30μg/ml HDL、1μM S1P均能显著增加内皮细胞PGI2的释放,而apoA1虽能增加内皮细胞PGI2的释放,但其升高的幅度比HDL、S1P要低。转染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重组表达质粒过表达SR-B1受体后,Western blot检测SR-B1蛋白表达成功上调,但过表达SR-B1没能显著增加HDL诱导内皮细胞PGI2的生成。RT-PCR、Western blot检测SR-B1三对siRNA序列均能下调SR-B1 mRNA及蛋白的表达,但其中以SR-B1 siRNA-S2作用最为明显,转染SR-B1 siRNA-S2 48小时后再与HDL孵育24小时,能显著减少HDL所诱导的内皮细胞PGI2生成。第二部分SR-B1介导HDL诱导内皮细胞PGI2释放的机制探讨目的:前期实验结果显示SR-B1参与介导HDL诱导内皮细胞PGI2的生成,故本实验主要探讨SR-B1影响HDL诱导内皮细胞PGI2释放的可能机制。方法:1.分别转染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重组表达质粒或SR-B1 siRNA 48小时后,30μg/ml HDL孵育24小时;2. 30μg/ml apoA1与ECV304内皮细胞共孵育24小时;3.分别用25μmol/L PI3K特异性抑制剂LY294002或50μmol/L eNOS特异性抑制剂L-NAME预处理3小时后,30μg/ml HDL孵育24小时。空白组作为阴性对照,30μg/ml HDL处理组为阳性对照,RT-PCR和/(或)Western blot检测PGIS、COX-2、CREB及磷酸化CREB的表达;免疫细胞化学法检测内皮细胞中COX-2蛋白的表达;ELISA法检测培养液中6-keto-PGF1的生成。结果:不管是mRNA水平还是蛋白水平,在过表达SR-B1后, HDL均不能显著上调COX-2的表达,然而,有趣地是siRNA沉默SR-B1后,可见HDL诱导内皮细胞COX-2的表达明显减少,且免疫细胞化学检测能得到相似的结果。30μg/ml apoA1孵育内皮细胞24小时后,COX-2表达亦出现增加。但是,不管是HDL单独处理还是过表达或沉默SR-B1,PGIS的表达都没有明显变化。抑制剂单独处理细胞对PGI2的生成没影响,但抑制PI3K或eNOS活性后可明显减少HDL诱导的PGI2生成,其中以抑制PI3K活性后,PGI2生成减少更为显著;同样,LY294002或L-NAME对HDL诱导内皮细胞COX-2、磷酸化CREB表达的影响与影响PGI2的生成呈相同效果,特异性抑制PI3K和特异性抑制eNOS活性均能下调HDL诱导的COX-2表达及CREB磷酸化,且同样以抑制PI3K后下调幅度更为明显。结论:1. HDL诱导内皮细胞COX-2的表达与PGI2的释放部分依赖HDL受体SR-B1。2.抑制内皮细胞PI3K或eNOS活性可下调HDL诱导的内皮细胞CREB磷酸化、COX-2表达及PGI2的生成,且以抑制PI3K活性后下调作用更为显著。3. HDL诱导内皮细胞PGI2释放依赖SR-B1与其介导的胞内PI3K-Akt-eNOS信号途径的激活有关。