背景:类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜成纤维细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLSs）的增殖、免疫细胞的浸润和血管翳的生成为主要病理表现的慢性系统性自身免疫性疾病。疾病进展会造成关节的滑膜组织损伤,最终致畸致残。但是到目前为止,RA的发病机制仍未完全诠释清楚。FLSs作为滑膜炎症中的重要参与者在疾病发生发展中的作用越来越受到人们的关注。成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）主要表达于活化的成纤维细胞表面,研究表明FAPα于肿瘤、肺纤维化等多种疾病中表达升高,并与肿瘤细胞侵袭性相关。那么在RA-FLSs中FAPα扮演怎样的角色,有待进一步研究与讨论。目的:（1）通过对公共测序数据分析筛选RA患者与健康对照（health control,HC）滑膜组织中与FAPα表达相关的差异基因,预测FAPα可能通过哪些通路影响RA疾病的进程。（2）通过体外细胞实验探讨FAPα对RA-FLSs增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,以及FAPα对细胞功能的影响是否与SHH信号通路相关,揭示FAPα在RA-FLSs中可能的生物学功能,为将来靶向FAPα+FLSs治疗RA的临床转化提供实验基础。方法:1.生物信息学分析:（1）RA和HC滑膜组织和平台信息数据下载于NCBI GEO数据库。对原始数据进行标准化处理后,使用R语言中“limma”软件包对RA与HC组中的差异基因进行筛选,设定阈值为|log FC|>1且P<0.05;根据基因测序数据中FAPα表达情况将数据分为高低表达两组,筛选差异基因,设定阈值为|log FC|>1且P<0.05。取两组差异基因交集作为下一步分析的关键基因。R语言中“ggplot2”软件包用于绘制RA与HC的火山图和聚类热图。（2）利用Bioconductor中的R package cluster Profiler（10）对关键基因进行GO分析和KEGG分析,P<0.05有统计学意义。（3）利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络,分析关键蛋白之间可能存在蛋白相互作用,找到FAPα可能的致病相关基因。2.FLSs的获取和鉴定:（1）RA-FLSs和骨关节炎（osteoarthritis,OA）的FLSs均在无菌条件中从关节置换术患者的滑膜组织分离获得,将组织剪碎并用胰蛋白酶消化处理,于含DMEM完全培养基中进行培养。FLSs为贴壁细胞,生长较为缓慢,平均3-4天后贴壁到达80%以上,进行传代培养。本课题所用的细胞均为3-6代细胞。（2）细胞鉴定主要从通过观察细胞形态以及使用FLSs的表面标志物（阳性）FAPα、PDPN和CDH11,以及巨噬细胞表面标志（阴性）CD68进行细胞鉴定。3.si RNA转染实验:设计合成FAPα的小干扰（small interfering RNA,si RNA）,通过使用GP-transfect-Mate将si RNA转染至RA-FLSs中。设置空白对照（Blank组）、阴性对照（NC组）和FAPα干扰组（si RNA组）。使用Real-time PCR和Western blot法分别从m RNA和蛋白水平检测FAPα的抑制情况,筛选干扰率最高的si RNA进行后续实验。4.细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的检测方法:（1）CCK8法检测实验组与对照组细胞增殖活性情况,利用流式细胞术对细胞的周期和凋亡进行检测,利用Transwell法比较各组FLSs细胞的迁移和侵袭能力改变;（2）Western blot法检测SHH信号通路SHH、PTCH1、GLI1蛋白的表达情况。结果:1.FAPα在RA滑膜中生物学作用的生物信息学分析:通过对RA和HC滑膜组织基因数据的分析,鉴定出与FAPα表达相关的关键基因,通过GO分析与KEGG分析进一步发现这些关键基因主要富集在类风湿关节炎,白细胞迁移、细胞与细胞间连接、细胞外基质胶原相关、受体配体和细胞因子活性、蛋白偶联受体结合、细胞因子受体结合、趋化因子和金属肽酶活性、CCR和CXCR趋化因子受体结合、纤维连接蛋白结合等几条重要信号通路。通过蛋白-蛋白相互作用网络筛选出FAPα表达相关的核心基因MMP1、MMP3、MMP13、CXCL9和CXCL13,经过Real-time PCR对RA-FLSs样本的验证发现MMP3、MMP13表达与FAPα表达差异相关。2.FAPα对FLSs细胞功能的影响:（1）对细胞增殖和周期的影响:细胞增殖检测表明,与NC组比较,转染24h和48h后si RNA组细胞生长率均受到了抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞周期检测表明与NC组相比,si RNA组中G0/G1期和S期所占的比例并没有明显的变化,但是G2/M期FLSs所占的比例降低（P<0.05）;（2）对细胞凋亡的影响:细胞凋亡检测表明,转染后48h si RNA组与NC组的细胞凋亡情况并没有显著性变化,差异无统计学意义（P>0.05）;（3）对细胞迁移和侵袭能力的影响:细胞迁移能力实验表明:与NC组比较,转染后24h si RNA组迁移能力无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）,侵袭实验表明转染后24h si RNA组侵袭能力明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）对RA-FLSs中SHH信号通路的影响:Western blot法结果表明,与NC组相比,si RNA组中SHH和GLI1相对表达量均降低（P<0.05）,但PTCH1表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.基因测序数据分析结果表明FAPα可以通过影响细胞因子受体结合、趋化因子活性、金属肽酶活性等细胞功能和信号通路影响RA滑膜病理学改变,并且与MMP3、MMP13等核心基因相关;2.FAPα的表达可以促进RA-FLSs的增殖和侵袭能力,但对细胞凋亡、迁移能力无明显作用;3.FAPα对RA-FLSs的增殖和侵袭能力的影响可以与其激活SHH信号通路相关。